王曉麗，畢振威，王永山，潘群興，歐陽偉，夏興霞，諸玉梅，董晨紅

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京210014）

·研究論文·

一株H3N2亞型犬流感病毒的分離與進化分析

王曉麗，畢振威，王永山，潘群興，歐陽偉，夏興霞，諸玉梅，董晨紅

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京210014）

2012年從南京市某寵物醫(yī)院采集的20份犬鼻拭子中分離到1株犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV），命名為A/ Canine/Nanjing/11/2012（H3N2）。該病毒分離株的血凝素（hemagglutinin，HA）效價為28，雞胚半數(shù)感染量（median embryo infective dose，EID50）和最小致死量平均死亡時間（mean death time，MDT）分別為10-7.60/0.1 mL和69.6 h/10-4。血凝素（HA）基因、神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）基因和核蛋白（necleoprotein，NP）基因的系統(tǒng)發(fā)育進化樹均顯示該分離株CIV位于禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）亞群中，并與H3N2亞型CIV遼寧分離株和黑龍江分離株位于同一分支上，具有最近的親緣關(guān)系（HA基因的同源性為99.5%～99.6%，NA基因的同源性為99.0%～99.2%，NP基因的同源性為99.1%～99.3%）。氨基酸序列分析顯示，該病毒分離株與其他犬流感病毒分離株的HA、NA和NP氨基酸序列存在個別位點的突變。

犬流感病毒；H3N2亞型；分離；變異；系統(tǒng)發(fā)育進化樹

流感病毒（Influenza virus，IV）A型屬于正粘病毒科、流感病毒屬，可感染人、馬、豬和禽類等多種宿主[1]。過去一般認為犬不是流感病毒A型的易感動物，但是近年來發(fā)現(xiàn)不同亞型的流感病毒可感染犬，引起犬發(fā)生咳嗽、噴嚏、流鼻涕和發(fā)熱等臨床癥狀[2]。2004年，美國佛羅里達發(fā)生了由馬源流感病毒H3N8亞型引起的犬流感。2007年在韓國流行的犬流感病毒是禽源流感病毒H3N2亞型。另外也有報道稱從犬體內(nèi)檢測到H5N1亞型流感病毒[3,4]。在2010年研究人員在中國廣東省分離到禽源H3N2亞型的犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV）[5]。Lin等[6]2009～2010年從江蘇省分離了6株H3N2亞型CIV，在系統(tǒng)發(fā)育樹上與韓國的1株貓源H3N2亞型禽流感病毒的親緣關(guān)系最近。2012年，從山東省某發(fā)病犬體內(nèi)檢出的CIV則被鑒定為是1株重配的H5N2亞型IV[7]。

近年來，由于犬養(yǎng)殖業(yè)和寵物犬行業(yè)的發(fā)展和興起，人類與犬的接觸日益頻繁和密切。鑒于犬類不斷發(fā)生流感以及犬在人類IV演變中扮演的角色還不清楚，對CIV進行分離和研究具有重要的公共衛(wèi)生意義。本研究從南京市寵物醫(yī)院具有呼吸道癥狀的犬群中分離到1株CIV，并對其血凝素（hemagglutinin，HA）、神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）和核蛋白（nucleoprotein，NP）基因進行了變異性分析。

1 材料與方法

1.1 病料與雞胚采集具有咳嗽、發(fā)燒、噴嚏、流涕臨床癥狀的犬鼻拭子樣本保存于30%甘油生理鹽水中，-20℃保存；10日齡SPF雞胚購自南京天邦生物科技有限公司。

1.2 主要試劑Trizol Reagent購自Invitrogen公司；Reverse Transcriptase XL（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、Ex Taq DNA聚合酶、DL5000 DNA Marker、pMD18-T載體、T4 DNA 連接酶均購自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收（小量）試劑盒購自上海華舜生物技術(shù)有限公司；E.coli Top10購自天根生化科技有限公司。

1.3 病毒分離將凍存的犬鼻拭子溶液用0.2 μm濾器過濾，經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，每個拭子接種3枚雞胚，0.1mL/枚。37℃孵育，棄去24 h內(nèi)死胚，每8 h觀察1次，出現(xiàn)的死胚置4℃保存，120 h后的存活胚置4℃過夜。無菌收集雞胚尿囊液，盲傳3代，測血凝效價，無血凝（hemagglutination, HA）活性者棄之。

1.4 雞胚終點稀釋法純化對有血凝活性的雞胚尿囊液做10倍梯度稀釋，選取10-6、10-7、10-8、10-9、10-10五個稀釋度分別接種5枚10日齡SPF雞胚尿囊腔，0.1 mL/枚，37℃孵育。分別收集24～120 h死胚和120 h活胚尿囊液，測定每胚的血凝（hemagglutination, HA）活性，選取最高稀釋度的含毒尿囊液按相同方法連續(xù)稀釋傳代3次。

1.5 EID50和MDT測定用無菌生理鹽水將純化的含毒尿囊液作10倍系列稀釋，取10-6、10-7、10-8、10-9四個稀釋度分別接種10日齡雞胚，上午8點每個稀釋度接種5枚雞胚，0.1 mL/枚。接種后剩余的病毒稀釋液4℃保存，下午5點每個稀釋度再同法分別接種剩余的5枚雞胚。接種后每日上午8點、下午5點，各照蛋1次，記錄每胚的死亡時間，并測定每胚HA活性。觀察7d后，將所有活胚冷卻，測定每胚HA活性，按Reed-Muench法計算病毒的雞胚半數(shù)感染量（median embryo infective dose，EID50），上午和下午接種的雞胚全部死亡的最高稀釋度即為最小致死量，計算雞胚最小致死量平均死亡時間（mean death time, MDT）。

1.6 引物設(shè)計與合成根據(jù)IV A型各RNA節(jié)段的5′端和3′端分別具有13和12個保守核苷酸，采用文獻[8]報道的引物序列（表1），對HA、NA和NP基因進行擴增。

1.7 病毒RNA的提取與RT-PCR擴增取純化的病毒雞胚尿囊液按Trizol Reagent的使用說明書提取總RNA。用IV反轉(zhuǎn)錄通用引物Uni-12進行反轉(zhuǎn)錄：8μL RNA、1 μL Uni-12、1 μL dNTPs，65℃作用5 min，冰上放置2 min；再加入0.5 μL MLV、0.5 μL RNA酶inhibitor、4 μL 5×緩沖液、DECP dd H2O 5 μL，42℃作用45 min，70℃作用15 min。以合成的cDNA為模板，用表1中特異性引物分別進行PCR擴增HA、NA和NP基因。PCR反應體系（25 μL）：12.5μL PCR Mix（2×）、9.5 μL ddH2O、上下游引物各1 μL、1 μL cDNA。PCR反應參數(shù)：94℃預變性4 min；94℃變性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸7 min，共進行30次循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

表1 RT-PCR擴增犬流感病毒HA、NA和NP基因的引物序列Table1 Primers for RT-PCR amplifi cation of CIV HA, NA and NP genes

1.8 基因克隆與測序?qū)A、NA、NP基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化后與pMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli Top10感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選和菌液PCR鑒定，選擇陽性克隆株送Invitrogen公司測序，將測序結(jié)果在GenBank中進行注冊。

1.9 HA、NA和NP基因的進化分析用DNAStar軟件對該犬流感病毒分離株以及在GenBank中注冊的其他代表性流感病毒株的HA、NA和NP基因進行同源性比較，并應用MEGA5.0軟件分別構(gòu)建HA、NA和NP基因的系統(tǒng)進化樹，分析其遺傳演化關(guān)系。

1.10 HA、NA和NP氨基酸序列分析用DNAStar軟件將該CIV分離株的HA、NA和NP氨基酸序列與其他流感病毒進行序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離20份犬鼻拭子樣品經(jīng)SPF雞胚盲傳、純化后，獲得1株CIV分離株。該分離株病毒的雞胚尿囊液對1%公雞紅細胞有血凝活性，血凝（HA）效價為28。

2.2 EID50和MDT的測定將病毒尿囊液做10倍梯度稀釋接種SPF雞胚后，經(jīng)HA活性測定，結(jié)果按Reed-Muench方法計算，該分離株病毒的雞胚半數(shù)感染量（EID50）為10-7.60/0.1 mL。當病毒尿囊液的稀釋度為10-4時，上、下午接種的雞胚全部死亡，MDT為69.6 h。

2.3 HA、NA和NP基因的擴增用HA、NA、NP基因的引物分別對該病毒分離株的cDNA產(chǎn)物進行PCR擴增，獲得大小約為1800、1500和1600 bp的片段，與預期大小相符（見圖1）。將PCR產(chǎn)物分別與克隆載體連接，篩選陽性重組質(zhì)粒進行測序，獲得HA、NA和NP基因序列依次在GenBank登錄號為KF322105、KF322106和KF322107。

2.4 HA、NA和NP基因的進化分析將病毒分離株與代表性IV的基因序列進行比對分析，分別構(gòu)建了HA、NA和NP基因的系統(tǒng)進化樹（見圖2、3、4）。在3個基因的系統(tǒng)進化樹中，所有的流感病毒分離株都分為馬源流感病毒、人/豬源流感病毒和禽流感病毒3個亞群。在HA基因系統(tǒng)進化樹中，病毒分離株CIV與H3N2亞型CIV遼寧分離株A/Canine/ Liaoning/27/2012（H3N2）和A/Canine/Liaoning/ H6/2012（H3N2）以及H3N2亞型黑龍江分離株A/ Canine/Heilongjiang/L1/2013（H3N2）位于同一分支上，親緣關(guān)系最近（基因序列同源性分別為99.6%、99.6%和99.5%），其次與2010年分離的6株H3N2亞型CIV江蘇分離株的同源性較高（基因序列同源性為99.1%～99.2%）。在NA基因系統(tǒng)進化樹中，該病毒分離株同樣與H3N2亞型CIV遼寧分離株A/Canine/ Liaoning/27/2012（H3N2）和A/Canine/Liaoning/ H6/2012（H3N2）以及H3N2亞型CIV毒黑龍江分離株A/Canine/Heilongjiang/L1/2013（H3N2）在同一分支上，同源性分別為99.2%、99.2%和99.0%，而與2010年分離的H3N2亞型CIV江蘇分離株的同源性為98.8%～99.2%。在NP基因系統(tǒng)進化樹中，該分離株CIV與H3N2亞型CIV遼寧分離株（A/Canine/ Liaoning/27/2012（H3N2）和A/Canine/Liaoning/ H6/2012（H3N2））以及H3N2亞型CIV黑龍江分離株（A/Canine/Heilongjiang/L1/2013（H3N2））的親緣關(guān)系（基因同源性分別為99.3%、99.2%和99.1%）仍然近于2010年分離的H3N2亞型CIV江蘇分離株的親緣關(guān)系（基因同源性為98.7%～98.9）。結(jié)果表明該犬流感病毒分離株為H3N2亞型，并在HA基因、NA基因和NP基因系統(tǒng)進化樹中均與2012年分離的2株H3N2亞型CIV遼寧分離株和2013年分離的1株H3N2亞型CIV黑龍江分離株的同源關(guān)系最近，將該病毒分離株命名為A/Canine/Nanjing/11/2012 （H3N2）。

圖1 HA(A)、NA(B)和NP(C)基因的RT-PCR擴增結(jié)果Fig.1 RT-PCR amplifi cation for HA(A), NA(B) and NP(C) genes of CIV M: DNA分子量標準；1、2: 分離株RT-PCR擴增產(chǎn)物

2.5 HA、NA和NP氨基酸序列分析本研究分離的H3N2亞型CIV分離株和H3N2亞型CIV江蘇分離株、廣東分離株、遼寧分離株和黑龍江分離株的HA氨基酸序列與其親緣關(guān)系最近的H3N2亞型禽流感病毒分離株（A/Aquatic bird/Korea/JN-2/2006 （H3N2））相比，共有的突變位點分別是T10A、L79F、D81N、L111I/V、A160T、D172N、G209S和W222L。其中，D81N、A160T和G209S發(fā)生在3個不同的抗原位點，T10A和D81N導致了潛在糖基化位點的改變，W222L發(fā)生在受體結(jié)合位點。但與其他CIV不同的是，A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2)有兩處獨特的突變位點（E218G和E241D），并不發(fā)生在抗原位點區(qū)域和受體結(jié)合位點，也沒有導致糖基化位點的改變。另外，與所有CIV株相同，A/Canine/Nanjing/11/2012（H3N2）的裂解位點是PERQTR↓G。

圖2 HA基因核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic trees of Infl uenza virus isolates based on the nucleotide sequences of HA gene

圖3 NA基因核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic trees of Infl uenza virus isolates based on the nucleotide sequences of NA gene

圖4 NP基因核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic trees of Infl uenza virus isolates based on the nucleotide sequence of NP gene

在NA氨基酸序列比對中發(fā)現(xiàn)，A/Canine/ Nanjing/11/2012（H3N2）和H3N2亞型CIV江蘇分離株、廣東分離株、遼寧分離株和黑龍江分離株與其親緣關(guān)系最近的H3N2亞型禽流感病毒分離株【A/duck/Korea/JS53/2004（H3N2）】的共同突變位點分別是M24L、E54K、P81S、D143N、P156S、I208V、D288N、S372L和R432G。其中，S372L、R432G發(fā)生在2個不同的抗原位點。A/Canine/ Nanjing/11/2012（H3N2）與H3N2犬流感病毒遼寧分離株、黑龍江分離株和江蘇分離株在NA頸部的末端均有2個氨基酸（E和K）的插入，這與犬流感病毒韓國分離株和廣東分離株不同。另外，A/Canine/ Nanjing/11/2012（H3N2）獨特的突變位點是N48S、I241V，但這些位點均未發(fā)生在抗原位點區(qū)域。

在NP氨基酸序列比對中發(fā)現(xiàn)，A/Canine/ Nanjing/11/2012（H3N2）和H3N2亞型犬流感病毒江蘇分離株、廣東分離株、遼寧分離株和黑龍江分離株與同源性最高的H6N5亞型禽源流感病毒分離株【A/mallard/Jiangxi/8346/04（H6N5）】發(fā)生的共同突變位點分別是Y52H、N125G、M159L、V353I、T373K、M374I、R389K、L418I、A428T、R452K、N473K[6]。A/Canine/Nanjing/11/2012（H3N2）與其他犬流感病毒相比，有兩個位點發(fā)生突變，分別是N50S和K236R。而在第456位點，A/Canine/ Nanjing/11/2012（H3N2）與同源關(guān)系最近的H3N2亞型犬流感病毒遼寧分離株和黑龍江分離株均是纈氨酸（V），而2009～2010年分離的H3N2亞型犬流感病毒江蘇分離株均是甲硫氨酸（M）。

3 討論

本研究將從南京市某寵物醫(yī)院采集的20份犬鼻拭子接種SPF雞胚，經(jīng)傳代和純化后獲得1株犬流感病毒，該病毒分離株對雞紅細胞的血凝HA效價達28，雞胚半數(shù)感染量（EID50）為10-7.60/0.1 mL、最小致死量平均死亡時間MDT為69.6 h/10-4。為進一步鑒定該犬流感病毒分離株，我們分別擴增了HA、NA 和NP基因，并進行了序列同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育進化分析，結(jié)果表明該病毒分離株為H3N2亞型犬流感病毒，命名為A/Canine/Nanjing/11/2012（H3N2）；該犬流感病毒分離株與H3N2亞型犬流感病毒遼寧分離株（A/Canine/Liaoning/27/2012（H3N2）和A/ Canine/Liaoning/H6/2012（H3N2）以及黑龍江分離株A/Canine/Heilongjiang/L1/2013（H3N2）的親緣關(guān)系最近，而不是與之前分離的H3N2亞型犬流感病毒江蘇分離株的親緣關(guān)系最近[6]，說明本實驗分離的犬流感病毒分離株出現(xiàn)了一定程度的變異。

流感病毒A型有囊膜，膜上含有血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）2種纖突，根據(jù)它們抗原特性的不同，將流感病毒分成不同的亞型，而NP蛋白是各個亞型或者亞型內(nèi)不同毒株之間氨基酸序列相當保守的蛋白，也是A、B、C 3型流感病毒型劃分的依據(jù)之一。Lin等[6]比較總結(jié)了犬流感病毒分離株與禽流感病毒分離株存在的共有氨基酸突變位點，其中HA的共同突變位點是T10A、L79F、D81N、L111I/V、A160T、D172N、G209S和W222L；NA的共同突變位點是M24L、N48S、E54K、P81S、D143N、P156S、I208V、D288N、S372L和R432G；而NP的共同的突變位點是G50S、Y52H、N125G、M159L、V353I、T373K、M374I、R389K、L418I、A428T、R452K和N473K。盡管HA的這些共同突變位點均可在A/Canine/Nanjing/11/2012（H3N2）中找到，但值得注意的是NA的N48S突變并未在該犬流感病毒分離株中發(fā)生；而NP的第50位與禽流感病毒的甘氨酸（G）和犬流感病毒的絲氨酸（S）均不同，A/Canine/Nanjing/11/2012（H3N2）分離株為天冬酰胺（N）。本研究獲得的犬流感病毒分離株HA、NA及NP蛋白氨基酸位點的變異對病毒特性以及抗原性的影響如何，值得進一步研究。

本研究分離的犬流感病毒分離株是繼2009～2010年江蘇省南京市分離到6株H3N2亞型CIV之后，又成功分離的1株H3N2亞型CIV。但該犬流感病毒分離株與之前的6株CIV分離株相比出現(xiàn)了不同程度的變異，在親緣關(guān)系上更接近于中國東北地區(qū)分離的H3N2亞型CIV分離株。該CIV的分離進一步豐富了CIV的病原學資料，對研究病毒進化機制和方向具有重要意義。

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CHARACTERIZATION OF H3N2 SUBTYPE CANINE INFLUENZA VIRUS ISOLATED IN 2012 IN NANJING, CHINA

WANG Xiao-li, BI Zhen-wei, WANG Yong-shan, PAN Qun-xing, OUYANG Wei XIA Xing-xia, ZHU Yu-mei, DONG Chen-hong

(National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-products, Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and
Technology, Ministry of Agriculture, Institute of Veterinary Medicine, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

In order to investigate the biological characteristics and molecular variation of Canine infl uenza virus (CIV), a total of 20 nasopharyngeal swabs from dogs with severe respiratory syndrome were obtained from animal clinics of Nanjing, Jiangsu province in 2012.A CIV strain designated as A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2) was isolated from these nasopharyngeal swabs using SPF embryonated chicken eggs.The hemagglutination titer, 50% embryo infectious dose (EID50) and mean death time (MDT) of this CIV strain were 28, 10-7.60/0.1 mL and 69.6 h/10-4, respectively.The phylogenetic analysis of HA, NA and NP genes showed that the CIV strain was categorized into H3N2 subtype avian subgroup as it shared high identities (99.5%～99.6% in HA gene, 99.0%～99.2% in NA gene and 99.1%～99.3% in NP gene) with three Chinese CIV strains A/Canine/Liaoning/27/2012(H3N2), A/Canine/Liaoning/H6/2012(H3N2) andA/Canine/Heilongjiang/L1/2013(H3N2).

Canine infl uenza virus; H3N2; isolation; variation; genetic evolution

S852.659.5

A

1674-6422（2015）02-0032-09

2014-09-29

江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新（CX(12)3062）

王曉麗，女，碩士，副研究員，主要從事新型獸用疫苗與檢測試劑盒研究

王曉麗，E-mail：xlw2003@163.com