王霄旸，王 米，張可煜，薛飛群

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 中國農(nóng)業(yè)科學院獸藥安全評價與獸藥殘留研究重點開放實驗室 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室，上海200241）

·簡報·

采用泊洛沙姆為佐劑的O型口蹄疫多肽疫苗對大鼠脾細胞的增值作用

王霄旸，王 米，張可煜，薛飛群

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 中國農(nóng)業(yè)科學院獸藥安全評價與獸藥殘留研究重點開放實驗室 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室，上海200241）

為研究泊洛沙姆作為佐劑的O型口蹄疫多肽疫苗對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響，采用四甲基偶氮唑鹽法（MTT）檢測不同濃度的泊洛沙姆407、 FMDV-O型泊洛沙姆佐劑多肽疫苗（多肽濃度50 μg/mL）、 FMDV O型多肽抗原液（7.06 mg/mL，用PBS稀釋至50 μg/mL）及FMDV O型油乳佐劑多肽疫苗（多肽濃度50 μg/mL） 對伴刀豆球蛋白A（Concanavalin A，ConA）處理淋巴細胞的增殖率。結果表明，與空白對照組相比較，泊洛沙姆各濃度對脾細胞均有增殖作用，多肽疫苗在高濃度的時候對細胞有抑制作用，隨著作用濃度的降低，又進而轉為細胞增殖作用。

細胞增殖; 泊洛沙姆; O型口蹄疫多肽疫苗

口蹄疫（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus， FMDV）感染引起的偶蹄動物共患的急性、烈性、高度接觸性傳染病，屬于微小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）、口瘡病毒屬（Aphthovirus），有 A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3 以及 Asia1 型等7個血清型。合成肽疫苗的研究最早始于FMDV合成肽疫苗，F(xiàn)MDV O型多肽抗原是利用化學方法人工合成FMDV O型毒株VP1結構中141～160位的氨基酸序列，同時，在VP1上結合輔助T細胞表位的環(huán)狀構造以增強疫苗的抗原性，克服了VP1環(huán)狀多肽只有B細胞表位的缺點，借助內源性和外源性的Th位點，進一步加強了T細胞免疫，另外雙硫鍵的存在提高了環(huán)狀構造的穩(wěn)定性[1-4]。

泊洛沙姆（poloxamer）是研究中最常用到的一種溫度敏感性凝膠聚合物，由聚氧乙烯與聚氧丙烯按比例構成。它具有毒性低、刺激性小、生物相容性好及特殊的反向熱膠凝性質，溫度升高，疏水鏈聚氧丙烯段失水聚合成為膠束，這些球形膠束內核是聚氧丙烯，外殼是水合膨脹的聚氧乙烯鏈繼續(xù)升溫，膠束有序排列形成凝膠[5-9]。研究表明泊洛沙姆可以作為疫苗佐劑，能夠顯著提高疫苗免疫效力[10,11]。

淋巴細胞轉化試驗是體外檢測T淋巴細胞功能的一種常用方法，可檢查體內對應的遲發(fā)型變態(tài)反應以及計算在Con A刺激下轉化成母細胞的數(shù)目，從而反映機體內的細胞免疫功能。MTT法的原理是活細胞內線粒體脫氫酶能將四氮唑鹽（MTT）由黃色還原為藍色甲臜，DMSO可溶解后者，活細胞數(shù)與甲臜成正比。酶標儀測定各孔吸光度值，判斷細胞內線粒體氧化活性，間接反映細胞的增殖反應。

本研究通過MTT法檢測泊洛沙姆作為FMDV O型多肽疫苗的佐劑對體外大鼠脾淋巴細胞增值的影響，來研究泊洛沙姆對疫苗免疫效力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 泊洛沙姆407（Poloxamer407）為德國BASF產(chǎn)品；FMDV O型多肽抗原液（7.06 mg/mL，用PBS稀釋至50 μg/mL）、 FMDV O型油乳佐劑多肽疫苗（多肽濃度50 μg/mL） 購自上海申聯(lián)生物有限公司。

1.1.2 主要試劑RPMI 1640培養(yǎng)液（(+) L-谷氨酸）為GIBCO公司產(chǎn)品，完全RPMI 1640培養(yǎng)液均另加20 mmol/L HEPES、1 mol/L 丙酮酸鈉，10%小牛血清，pH調整至7.2，無菌濾膜過濾除菌；HEPES、四氮唑鹽（MTT）（進口分裝ST316）、伴刀豆蛋白A (Con A)、Hanks，H00811-0897，PAA laboratories GmbH Tris、二甲基亞砜(DMSO)（進口分裝ST038）均購自碧云天生物技術研究所；無水乙醇，批號：20120508，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器 高壓蒸汽滅菌鍋：CL-40M，日本ALP公司；ESCO生物安全柜：AC2-4E1，Bio χ公司；倒置顯微鏡：Eclipse TS100，Nikon，Japan；高速冷凍離心機：Micro CL21R，Thermo electron corparation；渦旋混合器：Genie-2 (Scientific Industries Inc., Bohemia, NY, USA)；CO2培養(yǎng)箱：Nu.4750E, NUAIRE, U.S.A；酶標儀：Multiskan MK3型，Thermo Scientific, USA；96孔細胞培養(yǎng)板：美國Corning-Costar公司；細胞過濾器：70μm cell strainer （Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes， NJ USA）

1.1.4 實驗動物 Wistar大鼠，32只，清潔級，3～4周齡，體重60～80 g，雌性，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼以標準飼料，自由飲水、采食，觀察1周，健康正常大鼠用于實驗。

1.2 方法

1.2.1 脾淋巴細胞混懸液的制備 大鼠處死后浸泡于75%酒精溶液中5 min，解剖盤中無菌操作，左腹側中部開口分離脾臟結締組織，取出脾臟，放入盛有5 mL Hanks液的培養(yǎng)皿中，用注射器芯于細胞過濾器中進行研磨使單個脾淋巴細胞通過網(wǎng)篩。將含有細胞的Hanks液轉移至15 mL離心管中，4℃、250×g離心5 min；棄上清，細胞用Tris-NH4Cl沖洗，冰浴中3 min，250×g離心5 min；棄上清，完全RPMI 1640培養(yǎng)液沖洗細胞后250×g離心5 min；棄上清，完全RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮細胞，將細胞懸液稀釋10倍后計數(shù)，用完全RPMI 1640培養(yǎng)液調整細胞濃度6×106個/mL。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及增殖作用檢測 將1.2.1中調整好濃度的細胞加入96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每個樣品5個孔，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；取出樣品板分為靜息期細胞、ConA處理細胞、4組樣品處理細胞組，每組加入100 μL樣品，每個樣品設5個濃度梯度，依次由低到高分別為原樣品濃度的1/10、1/20、1/40、1/80，每個樣品重復5次。 每個待測樣品除靜息期組外分別每孔加入Con A（終濃度為10 mg/L），繼續(xù)培養(yǎng)64 h；培養(yǎng)結束前4 h取出培養(yǎng)板每孔加入20 μL MTT（終濃度為0.5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h；細胞培養(yǎng)板250×g離心3 min，每孔吸出100 μL上清后加DMSO 100 μL，震蕩5 min，酶標儀測570 nm處吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理計算細胞增值率%=（待測組A-空白對照組A）/空白對照組A，結果采用Prism6.0軟件對數(shù)據(jù)進行作圖。

2 結果與討論

結果發(fā)現(xiàn)，泊洛沙姆各濃度對脾細胞均有增殖作用，多肽疫苗在高濃度的時候對細胞有抑制作用，隨著作用濃度的降低，又進而轉為細胞增殖作用。增值率結果見表1及圖1。由此可見，泊洛沙姆具有促進大鼠脾細胞增殖作用，但不具有濃度依賴性，證實其具有免疫增強作用，能夠作為疫苗佐劑。但由于O型口蹄疫多肽在濃度高時具有細胞抑制作用，而低濃度又轉為細胞增殖作用，說明多肽疫苗直接作用于大鼠脾細胞，存在一定的細胞毒性，但對這一定論還需要進一步研究。

表1 MTT法分析脾淋巴細胞增殖活性Table1 Spleen lymphocytes stimulated activity by MTT assay

圖1 MTT法分析脾淋巴細胞增殖活性Table1 Analysis of spleen lymphocytes proliferative activity in Wistar rat by MTT assay after immunization

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ADJUVANT EFFECT OF POLOXAMER ON FOOT-AND-MOUTH DISEASE VIRUS TYPE O PEPTIDE VACCINE REGARDING IN VITRO PROLIFERATION OF RAT SPLEEN LYMPHOCYTES

WANG Xiao-yang, WANG Mi, ZHANG Ke-yu, XUE Fei-qun

(Key Laboratory of Veterinary Drug Safety Evaluation and Residues Research, Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The use of poloxamer as adjuvant of Foot-and-mouth disease virus (FMDV) type O peptide vaccine was studied using proliferation of rat spleen lymphocytes as a parameter.The MTT assay was used to detect the increase rates of rat spleen lymphocytes at different concentrations of Poloxamer 407 and FMDV type O peptide vaccine.The optimal proliferation of rat spleen lymphocytes was observed with poloxamer concentration at 50 μg/mL and FMDV type O polypeptide antigen liquid at 50 μg/mL.As compared with the blank control group, the use of poloxamer as adjuvant signifi cantly enhanced the lymphocyte proliferation.However, the negative effect on the lymphocyte proliferation was observed at high peptide concentration but turned to positive at lower concentration.

Lymphocytes proliferation; poloxamer; FMDV type O peptide vaccine

S852.4

B

1674-6422（2015）02-0074-04

2014-12-02

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))專項經(jīng)費(201303038)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金項目(2013JB11)

王霄旸，女，碩士，助理研究員，主要從事獸用藥物制劑研究

薛飛群，E-mail：fqxue@shvri.ac.cn