類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血CD4 T細(xì)胞關(guān)節(jié)局部趨化機(jī)制

王克軍

(荊州市中心醫(yī)院骨二科，湖北荊州434020)

摘要〔〕目的探討類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者外周血CD4 T細(xì)胞比例變化情況及其對(duì)關(guān)節(jié)局部趨化的機(jī)制。方法流式細(xì)胞術(shù)分析RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中CD4 T細(xì)胞的比例，并分析CD4 T細(xì)胞比例與RA 疾病活動(dòng)性評(píng)分系統(tǒng)(DAS28)評(píng)分間的關(guān)系。激光共聚焦方法檢測(cè)RA患者滑膜局部浸潤(rùn)C(jī)D4 T細(xì)胞情況。流式細(xì)胞術(shù)分析RA患者CD4 T細(xì)胞表面趨化因子受體表達(dá)情況。結(jié)果與對(duì)照組相比，RA患者外周血PBMC中CD4 T細(xì)胞的比例顯著降低(P<0.01)，且RA患者外周血CD4 T細(xì)胞比例與DAS28評(píng)分呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.753 0，P=0.001 2)。關(guān)節(jié)局部CD4 T細(xì)胞浸潤(rùn)的激光共聚焦結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，RA患者滑膜中具有更多的CD4 T細(xì)胞浸潤(rùn)。趨化因子受體分析結(jié)果顯示，RA患者外周血CD4 T細(xì)胞表面CCR5、CXCR1和CXCR3的表達(dá)顯著升高(P<0.01)。結(jié)論RA患者外周血CD4 T細(xì)胞表面表達(dá)升高的CCR5、CXCR1和CXCR3可能參與外周血CD4 T細(xì)胞向滑膜局部的趨化。

關(guān)鍵詞〔〕類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；外周血；CD4 T細(xì)胞；關(guān)節(jié)；趨化

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R593.22〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

第一作者：王克軍(1970-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事關(guān)節(jié)和脊柱研究。

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)其病理特征主要表現(xiàn)為：(1)以T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及其分泌的大量炎癥細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1、γ-干擾素(IFN-γ)等引起的慢性、持續(xù)性滑膜炎癥；(2)由單核細(xì)胞在炎癥部位分化為有活性的破骨細(xì)胞(OC)所介導(dǎo)的侵蝕性、進(jìn)行性骨質(zhì)破壞〔1～4〕。CD4+T細(xì)胞作為IL-2、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子的主要來(lái)源，其免疫分化異常是RA 等系統(tǒng)性自身免疫性疾病發(fā)病的主要免疫病理機(jī)制之一〔5〕。目前關(guān)于外周血CD4 T細(xì)胞是否可趨化至RA患者滑膜局部參與RA發(fā)病及相關(guān)的機(jī)制研究的還不是很清楚。本研究首先通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中CD4 T細(xì)胞的比例，并分析CD4 T細(xì)胞比例與RA 疾病活動(dòng)性評(píng)分系統(tǒng)(DAS28)評(píng)分間的關(guān)系；通過(guò)激光共聚焦方法檢測(cè)RA患者滑膜局部浸潤(rùn)C(jī)D4 T細(xì)胞情況及流式細(xì)胞術(shù)分析RA患者CD4 T細(xì)胞表面趨化因子受體表達(dá)情況，以明確外周血CD4 T細(xì)胞關(guān)節(jié)局部趨化機(jī)制。

1材料與方法

1.1臨床資料收集2014年3～12月入院檢查診斷為RA且臨床資料完整的初治患者15例，同時(shí)收集健康體檢患者15例。RA患者平均年齡(46.56±8.42)歲，均符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)學(xué)會(huì)RA分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組平均年齡(47.42±10.34)歲。通過(guò)RA患者DAS28評(píng)分軟件計(jì)算15例患者RA患者DAS28評(píng)分。

1.2主要試劑Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自GE Healthcare公司；流式細(xì)胞染色的CD4抗體、CCR1-CCR10、CXCR1-CXCR6和CX3CR1購(gòu)自Biolegend公司；激光共聚焦實(shí)驗(yàn)所有CD4抗體購(gòu)自R&D公司；PRMI-1640購(gòu)自Hyclone公司；滑膜組織冰凍切片由公司代為完成。

1.3外周血單個(gè)核細(xì)胞獲取方法抽取RA患者及對(duì)照組空腹外周血1 ml，通過(guò)Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分取PBMC。具體方法：采用PRMI-1640對(duì)采集的外周血進(jìn)行1∶1的稀釋?zhuān)瑢⑾♂尩耐庵苎尤腩A(yù)先裝有淋巴細(xì)胞分離液的15 ml離心管中(稀釋血：淋巴細(xì)胞分離液=2∶1)；1 800 r/min離心20 min，吸取中間白膜層加入預(yù)先裝有PRMI-1640的15 ml離心管中，1 500 r/min離心15 min；棄去上清再以PRMI-1640洗滌1次；采用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4流式細(xì)胞染色方法按照每個(gè)染色條件1×106個(gè)細(xì)胞取所需細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞采用含1%胎牛血清(BSA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入相應(yīng)的抗體，4℃孵育30 min，隨后采用含1%BSA的PBS洗滌2次；細(xì)胞以100 μl含1%BSA的PBS重懸進(jìn)行檢測(cè)。

圖1　RA患者外周血CD4 T細(xì)胞比例與DAS28相關(guān)性分析

1.5激光共聚焦染色方法冰凍切片以1 ml PBS洗2次；4%多聚甲醛1 ml室溫固定20 min；1 ml PBS洗2次；含3 μg/ml CD4抗體的染色Buffer室溫染色1 h；1 ml PBS洗3次，5 min/次；將片子于空氣中吹干；ProLong Gold Antifade Reagent封片。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Graphpad prism 5.0分析軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)分析。

2結(jié)果

2.1RA患者外周血CD4 T細(xì)胞比例變化情況RA患者外周血CD4 T細(xì)胞比例為(22.6±5.24)%，顯著低于對(duì)照組的(38.9±7.34)%(P<0.01)。

2.2RA患者外周血CD4 T細(xì)胞比例與病情相關(guān)性分析RA患者外周血CD4 T細(xì)胞比例與RA患者DAS28評(píng)分呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.753 0，P=0.001 2)。見(jiàn)圖1。

2.3RA患者滑膜局部CD4 T細(xì)胞浸潤(rùn)情況分析RA患者滑膜局部浸潤(rùn)C(jī)D4 T細(xì)胞數(shù)為(58.96±7.38)，顯著高于對(duì)照組的(3.00±2.26)(P<0.01)。

2.4RA患者外周血CD4 T細(xì)胞表面趨化因子受體表達(dá)情況分析同對(duì)照組相比，RA患者外周血CD4 T細(xì)胞表面CCR5、CXCR1和CXCR3的表達(dá)顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2　流式細(xì)胞染色檢測(cè)RA患者外周血CD4 T細(xì)胞 表面趨化因子受體表達(dá)情況

3討論

RA是一種慢性自身免疫性疾病，關(guān)節(jié)炎癥和自身抗體產(chǎn)生為發(fā)病的關(guān)鍵因素〔6〕。RA的發(fā)病過(guò)程目前還未完全研究清楚。流行病學(xué)調(diào)查顯示，RA 的全球發(fā)病率約為1%。RA 病程反復(fù)遷延，發(fā)病1年內(nèi)致殘率高達(dá)20%，是造成人類(lèi)勞動(dòng)力喪失和致殘的主要原因之一。遺憾的是，目前所采用的治療手段僅可降低RA 患者的致殘率，但仍無(wú)法從根本上阻止RA 的炎癥性關(guān)節(jié)破壞〔7〕。

大量研究證據(jù)表明，滑膜局部浸潤(rùn)炎性細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子在RA關(guān)節(jié)病變中具有重要的作用〔8〕。T細(xì)胞亞群對(duì)機(jī)體免疫功能的穩(wěn)定起著重要的調(diào)節(jié)作用，研究顯示T細(xì)胞在滑膜局部的浸潤(rùn)數(shù)量明顯升高，局部浸潤(rùn)的T細(xì)胞在 RA滑膜關(guān)節(jié)處形成類(lèi)似于異位淋巴細(xì)胞生發(fā)中心的結(jié)構(gòu)。T細(xì)胞主要分為具有殺傷功能的CD8 T細(xì)胞和具有輔助功能的CD4 T細(xì)胞。CD4 T 細(xì)胞作為IL-2、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子的主要來(lái)源，其免疫分化異常是RA 等系統(tǒng)性自身免疫性疾病發(fā)病的主要免疫病理機(jī)制之一〔5〕。目前關(guān)于CD4 T 細(xì)胞在RA患者關(guān)節(jié)局部的浸潤(rùn)情況及相關(guān)機(jī)制研究還不是很清楚。

本研究結(jié)果初步提示，RA患者外周血CD4 T細(xì)胞比例的降低并非是對(duì)RA發(fā)病的一種保護(hù)作用，而可能是被趨化至RA滑膜局部參與RA發(fā)病。細(xì)胞的局部趨化與趨化因子和趨化因子受體的相互作用密切相關(guān)。同時(shí)，本研究還證實(shí)RA患者外周血CD4 T細(xì)胞表面表達(dá)升高的CCR5、CXCR1和CXCR3可能參與外周血CD4 T細(xì)胞向滑膜局部的趨化。

4參考文獻(xiàn)

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8McInnes IB，Schett G.Cytokines in the pathogenesis of rheumatoid arthritis〔J〕.Nat Rev Immunol，2007;7(6)：429-42.

〔2015-04-11修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)