308 nm準分子激光聯(lián)合胡椒堿對毛囊外根鞘無色素黑素細胞黑素合成及酪氨酸酶相關蛋白酶-1、-2 蛋白表達的促進作用

吳一菲曹萍王曉川高飛薛琴

(云南省第一人民醫(yī)院皮膚科，云南昆明650032)

摘要〔〕目的研究308 nm激光聯(lián)合胡椒堿對毛囊外根鞘無色素黑素細胞(AMMC)黑素合成及酪氨酸酶相關蛋白酶(TRP)-1、TRP-2 蛋白表達的影響。方法體外培養(yǎng)的AMMC細胞分別以聯(lián)合療法組、308 nm激光組、胡椒堿組、陽性對照組及空白對照組作用24、72及120 h，測定黑素含量，激光共聚焦顯微鏡觀察并定量分析熒光染色后細胞內TRP-1、TRP-2的表達情況。結果4組均能促進AMMC細胞黑素量生成。聯(lián)合治療組、308 nm激光組、胡椒堿組、陽性對照組均不同程度的促進黑素含量的增加，其中以聯(lián)合治療組促進作用最強。胡椒堿呈濃度依賴性促進黑素合成且作用72 h時效果最明顯。0.5 mmol/L胡椒堿作用72 h可促進表皮黑素細胞TRP-1表達，而對TRP- 2的表達無明顯影響。308 nm激光對TRP-1、TRP-2均有促進作用。結論308 nm激光聯(lián)合胡椒堿能促進AMMC細胞的黑素合成。

關鍵詞〔〕308 nm激光；胡椒堿；黑素細胞，無色素；毛囊外根鞘；黑素合成

中圖分類號〔〕R739.5〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：云南省科技計劃項目(2010ZC207)；云南省第一人民醫(yī)院“昆華·奧新”科技計劃項目(2014DS003)

通訊作者：王曉川(1978-)，女，主治醫(yī)師，醫(yī)學碩士，主要從事色素障礙性皮膚病研究。

第一作者：吳一菲(1968-)，女，主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事色素障礙性皮膚病研究。

308 nm激光聯(lián)合胡椒堿有較強的促黑素合成作用。本文繼續(xù)深入研究聯(lián)合治療組對毛囊外根鞘無色素黑素細胞(AMMC)黑素合成及酪氨酸酶相關蛋白酶(TRP)-1、TRP-2 蛋白表達的影響，并對其可能機制進行初步探討。

1材料與方法

1.1試劑和儀器二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶(均為美國Sigma公司產品)，脫氧膽酸鈉(美國Amersco公司)，RMPI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，新小牛血清(杭州四季青生物材料有限公司)，其他試劑均為分析純。722分光光度計(上海精密分析儀器有限公司)，Clinibio 128C酶聯(lián)免疫檢測儀(澳大利亞Clinibio公司)，96孔培養(yǎng)板(美國,Corning公司)。蘑菇酪氨酸酶，左旋多巴(DL-Dopa)購自美國Sigma公司。三蒸水將DL-Dopa配成2.5 ml溶液，蘑菇酪氨酸酶配成25 IU/ml備用。治療儀器為Xtrac巔峰準分子激光系統(tǒng)(美國photomedex公司)，工作物質為氯化氙氣體，產生激光波長為308 nm。

1.2藥品胡椒堿由中國藥品生物檢定所提供，DMSO配制成20 mg/ml的原液，-20℃保存，臨時用新鮮培養(yǎng)液調至終濃度為0.1、0.5、1.0 mmol/L。陽性對照藥8-甲氧補骨脂素(8-Mop，江蘇潥陽制藥廠)，以DMSO溶解。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng)將首次傳代培養(yǎng)，70%～80%融合狀態(tài)的AMMC作為研究對象。用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，待生長至融合狀態(tài)，以0.25%胰酶和0.02%EDTA消化，錐蟲藍染色法計數(shù)活細胞數(shù)，然后接種至250 ml玻璃培養(yǎng)瓶，接種密度為104/cm2，液體量15 ml/瓶。細胞接種24 h后，用含藥物的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)孵育72 h后收獲細胞，計數(shù)，將細胞分為2份分別用于黑素含量測定和激光共聚焦熒光定量分析。為減少AMMC細胞培養(yǎng)基中其他添加成分可能對試驗的影響，試驗前3 d用不含F(xiàn)CS的DMEM基礎培養(yǎng)基給細胞換液1次。

1.3.2實驗分組 分5組。聯(lián)合治療組：308 nm準分子激光以能量300 mJ/cm2照射并聯(lián)合0.5、1.0、0.1 mmo/L 胡椒堿；308 nm激光組:僅以能量300 mJ/cm2照射AMMC細胞；胡椒堿組：以0.5、1.0、0.1 mmol/L胡椒堿作用于AMMC細胞；陽性對照組：308 nm激光(能量參數(shù)同前)聯(lián)合8-Mop(0.1 mmol/L)；空白對照組：僅加入等量相應溶媒，不照射。

1.3.3黑素含量測定黑素量的測定參照Ando等〔1〕的方法并加以改良，收獲細胞，用血細胞計數(shù)器進行細胞計數(shù)(重復4次取均值)，PBS液洗2次，加入200 μl的雙蒸水使細胞懸浮，加入1 ml的乙醇、乙醚混合液(1∶1)室溫下放置15 min，然后離心5 min(3000 r/min)，沉淀加入1 mol/L NaOH(含10%DMSO)1 ml，置80℃30 min溶解黑素，加入4 ml雙蒸水將NaOH稀釋成0.2 mol/L，用分光光度計測定黑素的吸光度(A475 mm)。黑素含量以(藥物處理組A475/細胞數(shù))/(空白對照組A475/細胞數(shù))×100來表示。每一實驗重復4次。

1.3.4激光共聚焦熒光定量分析按照文獻〔2〕的方法,激光共聚焦顯微鏡觀察和熒光定量分析取6孔培養(yǎng)板內各組作用3、5、7 d的蓋玻片上的AMMC，PBS 洗3次，每次5 min，浸入4%多聚甲醛液中室溫固定20 min，把蓋玻片的細胞面朝上置于一張濾紙上，放入有蓋平皿中。用封閉羊血清覆蓋細胞封閉10 min，以減少蓋玻片上非特異抗體的影響。吸掉封閉羊血清，分別滴加一抗溶液：兔抗人酪氨酸酶抗體(1∶150)、兔抗人TR-P1抗體(1∶150)、兔抗人TRP2抗體(1∶150)，37℃孵育60 min。PBS 沖洗5 min 共3次，加入FITC標記的山羊抗兔IgG二抗溶液(1∶100)，37℃孵育30 min。將蓋玻片在PBS緩沖液中洗3次，用濾紙吸掉周邊水分，每待測樣品加入0.2 ml PBS后，分別置于聯(lián)結電腦的激光共聚焦顯微鏡下，選擇×40物鏡，×10目鏡，7%濾光片，激發(fā)光波長為488 nm，預掃描后選定最佳細胞掃描參數(shù)，鎖定參數(shù)。每個觀察指標選取3個視野，激光掃描2次后，記錄胞質、胞核中的平均熒光強度，存儲所采集的實驗數(shù)據。本實驗以胞質中的平均熒光灰度為判斷TRP1、TRP2表達的指標，選取3個視野中的10個細胞進行熒光灰度定量分析。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS10.0軟件行t檢驗。

2結果

2.1308 nm激光及胡椒堿對AMMC形態(tài)的影響傳代培養(yǎng)的AMMC細胞呈紡錘形，主要有兩極；細胞經308 nm激光照射及胡椒堿作用后，細胞胞體增大，樹突增多并延長(圖1)。

2.2不同觀察組對AMMC細胞黑素合成及酪氨酸相關蛋白酶的影響表1顯示，聯(lián)合治療組作用最強。胡椒堿能以濃度依賴方式促進黑素量增加。其中當聯(lián)合治療組胡椒堿濃度為0.5 mmol/L、72 h時作用最明顯，較陽性對照組8-MOP濃度0.1 mmol/L、作用120 h及空白對照組黑素生成明顯增加(t= 3.50，P<0.05；t=4.32，P<0.01)；陽性對照組在8-MOP濃度為0.1 mmol/L、120 h時作用最強，較空白對照組黑素含量明顯增加(t=4.45,P<0.01)；激光組作用72 h及120 h時黑素含量較空白對照組明顯增強(t= 5.62,P<0.01;t= 5.77,P<0.01)；胡椒堿組在濃度為0.5 mmol/L、72 h時較空白對照黑素含量明顯增加(t=7.52,P<0.01)。對酪氨酸相關蛋白酶作用結果顯示，聯(lián)合治療組在胡椒堿濃度為0.5 mmol/L、72 h時對TRP-1較陽

組別濃度(mmol/L)黑素含量24h72h120h酪氨酸相關蛋白酶-1酪氨酸相關蛋白酶-2聯(lián)合治療組胡椒堿0.5310.13±52.411)2)510.25±12.552)3)487.20±56.332)3)330.77±71.26220.33±11.551.0330.22±10.56430.22±30.12400.00±10.52250.12±35.62220.86±78.960.1336.30±15.27410.05±30.22395.26±37.15230.75±19.22219.33±6.37陽性對照組8-MOP濃度0.1274.18±31.651)375.70±78.252)408.44±15.332)270.88±11.56285.66±11.330.5245.66±10.87347.23±40.32370.33±71.65250.77±13.92230.56±3.23激光組-287.55±89.32330.33±20.882)368.32±15.872)235.55±76.22218.77±6.37胡椒堿組胡椒堿0.5140.56±67.88300.72±11.852)270.10±82.172)158.96±30.2238.75±31.531.0130.57±11.62250.52±81.332)200.77±91.342)102.44±70.5637.33±41.860.1110.11±18.24146.75±15.36178.26±36.141)98.57±30.1236.52±10.57空白對照組100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.0041.22±10.5545.12±18.97

空白對照組相應值設定為100%；與空白對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與0.1 mmol/L 8-MOP組比較：3)P<0.05

性對照組及空白對照組有明顯促進作用(t=11.43，P<0.05；t=6.34,P<0.01)；對TRP-2較空白對照組比較有明顯差異(t= 9.56，P<0.01)；陽性對照組對TRP-1、TRP-2均有明顯促進作用，較空白對照組明顯增高(t=5.23,P<0.01；t=6.52，P<0.01)；激光組對TRP-1、TRP-2較空白對照組有明顯促進作用(t=10.64，P<0.05；t=9.32，P<0.01)；0.5 mmol/L胡椒堿作用后AMMC細胞內TRP-1的表達量較空白對照組高(t=6.34，P<0.01)；對TRP-2表達無明顯促進作用。與空白對照組比較無差異(P>0.05)。見圖1。

圖1　308 nm激光聯(lián)合胡椒堿對AMMC細胞形態(tài)的影響 (激光共聚焦顯微鏡,×100)

3討論

白癜風是最常見的皮膚色素脫失性疾病，嚴重影響患者容貌。盡管不斷有新療法出現(xiàn)，但整體而言，白癜風治療效果仍極不令人滿意，迫切需要新的更有效的治療方案、手段和理論。黑素細胞(MC)缺失是發(fā)病的關鍵。MC發(fā)育學研究已證實：位于毛囊外根鞘的無色素黑素細胞是表皮MC的主要來源，在多種因素作用下，休眠狀態(tài)毛囊外根鞘無色素黑素細胞被活化，經過黏附等一系列環(huán)節(jié)遷移到表皮并進一步增殖、活化，完成表皮著色過程〔3〕。這一過程也同樣存在于白癜風復色中。臨床現(xiàn)象也支持上述觀點。白癜風白斑的復色往往先起自毛囊口，在毛囊口周圍首先形成色素性皮島，繼而逐漸擴大。因此促進AMMC的活化、黏附因素對增加白癜風皮損區(qū)MC的數(shù)量和功能極為關鍵。308 nm準分子激光是近年來出現(xiàn)的治療白癜風的一種新型治療方法，其治療的主要光源是由氙原子和氯原子組成的二聚體。其發(fā)出的連續(xù)的脈沖氣體激光，屬UVB波長范圍〔4〕。EL是白癜風治療領域最新的手段之一，其有效率高于其他方法已得到國內外研究的公認〔5〕。但EL作用機制研究主要集中于它促進T細胞凋亡和干預角質形成細胞對MC的抑制〔6〕，是否可以直接作用于AMMC細胞，促進黑素生成的作用研究較為缺乏。

整體而言，白癜風治療有效率仍不令人滿意〔7〕。胡椒堿具有較強的MC活化作用，是較理想的白癜風備選外用藥物。本研究結果表明：EL及胡椒堿均有促進AMMC細胞活化，黑素形成的作用。其中，胡椒堿呈濃度依賴性，在0.5 mol/L作用72 h對黑素量生成影響作用最強，這與馬慧軍等〔8〕結論一致。

黑素細胞合成黑素是一種多步驟多酶參與的復雜過程。酪氨酸酶是黑素合成中最為關鍵的一種限速酶，許多種藥物都是通過上調該酶的生物合成或對該酶的分子結構進行翻譯后的重修飾，增強其生物學活性來發(fā)揮作用的〔9〕。TRP-1和TRP-2同屬于酪氨酸酶基因超家族成員，二者催化黑素生化合成過程中的后續(xù)步驟，在黑素細胞內它們與酪氨酸酶一起以多酶復合體形式存在，并對該復合體起穩(wěn)定作用。 TRP-1催化活性較弱，研究發(fā)現(xiàn)TRP-1 mRNA 只在含有優(yōu)黑素的細胞中出現(xiàn),表明TRP-1在優(yōu)黑素生成過程中具有重要作用〔10〕。TRP-2功能是催化多巴色素轉變?yōu)?、6-二羥基吲哚-2-羧酸(DHICA),控制著DHICA/DHI的比例,具有加速黑素生成作用。激光共聚焦定量分析熒光染色后的AMMC細胞TRP-1和TRP-2的表達發(fā)現(xiàn)胡椒堿作用后TRP-1的表達量較空白對照高，而TRP-2的表達量與空白對照組無差異，這與馬慧軍等〔11〕所作觀察結論一致。提示胡椒堿的促表皮黑素細胞黑素合成的作用可能通過上調TRP-1的表達發(fā)揮作用而與TRP-2無明顯關系。由于TRP-1主要與優(yōu)黑素的生成密切相關，我們推測胡椒堿可能主要促進了黑素細胞中優(yōu)黑素的合成。另外，觀察結果顯示，EL對TRP-1、TRP-2均有促進作用，對黑素合成有明顯促進作用。

本研究明確了EL對AMMC細胞直接的活化和促進黑素生成的作用，為今后的進一步研究提供了更好的理論基礎。

4參考文獻

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〔2014-04-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)