老年冠心病人群的FVLeiden基因突變

張靜翟麗杰

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院藥品管理部，吉林長(zhǎng)春130041)

摘要〔〕目的探討老年冠心病人群凝血因子V(FV)Leiden突變的發(fā)生率。方法應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)對(duì)167例老年冠心病人群(其中28例蒙古族，29例回族和110例漢族)和69例漢族健康人群進(jìn)行FVLeiden基因突變研究分析。結(jié)果該老年冠心病人群和健康人群個(gè)體均未檢出FVLeiden基因突變類(lèi)型，包括純合子和雜合子。結(jié)論老年冠心病人群中，蒙古族、回族、漢族冠心病患者和健康人群均未見(jiàn)到FVLeiden基因突變，提示FVLeiden突變可能不是冠心病形成的主要危險(xiǎn)因素。

關(guān)鍵詞〔〕冠心??；基因突變；凝血因子

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R541〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

通訊作者：翟麗杰(1973-)，女，主管藥師，碩士，主要從事藥理學(xué)研究。

第一作者：張靜(1975-)，女，副主任藥師，碩士，主要從事藥理學(xué)研究。

研究〔1〕發(fā)現(xiàn)深靜脈血栓患者中約20%～60%的血栓發(fā)生機(jī)制與活化蛋白C抵抗(APC-R)相關(guān)，其中凝血因子V(FV)Leiden基因1691A→G突變是APC-R的主要原因之一〔2〕。研究〔5〕表明，F(xiàn)VLeiden基因突變存在著世界性的地理異質(zhì)性和種族差異性。冠心病、高血壓患者處于一定的血栓前狀態(tài)，與FVLeiden基因突變是否有密切關(guān)系目前還未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法，對(duì)老年冠心病人群和健康人群的FVLeiden基因型頻率和基因頻率進(jìn)行研究，為進(jìn)一步研究其與中國(guó)老年冠心病人群的相關(guān)性提供理論依據(jù)。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象167例均無(wú)血緣關(guān)系的老年冠心病患者，年齡65～70歲，男74例，女71例；28例蒙古族，29例回族，110例漢族。隨機(jī)抽取69例無(wú)血緣關(guān)系的漢族健康人群作為對(duì)照組。

1.2儀器與試劑PCR儀，S1000型，美國(guó)Bio-Rad公司；凝膠成像分析系統(tǒng)，Gel Doc XR型，美國(guó)Bio-Rad公司；臺(tái)式低溫離心機(jī)Sigma3K30型，德國(guó)Sigma公司；血液基因組提取試劑盒(9450)，TaKaRa Premix TaqTM酶及HindⅢ內(nèi)切酶均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3FVL基因突變檢測(cè)

1.3.1血液核酸提取全部研究對(duì)象抽外周靜脈血1 ml，置于乙二胺四乙酸抗凝管內(nèi)，充分混勻后放入-20℃冰箱中保存待檢。取冷凍保存的抗凝全血100 μl于1.5 ml離心管中，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行核酸提取。

1.3.2PCR擴(kuò)增引物根據(jù)文獻(xiàn)〔4〕由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列：正義：5′-TCAGGCAGGAACAACACCAT-3′，反義：5′-GGTTACTTCAAGGACAAAATACCTGTA AAGCT-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μl，其中DNA模板1 μl，2×mix 12.5 μl，上游引物(10 μmol/L)0.5 μl，下游引物(10 μmol/L)0.5 μl，補(bǔ)充ddH2O至25 μl。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，55℃退火30 s，72℃延伸20 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃ 延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，并置凝膠成像儀上觀察特異性條帶，正常PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為241 bp，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.3PCR-RFLP分析取上述成功擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物10 μl，10倍緩沖液：2 μl，Hind Ⅲ限制性核酸內(nèi)切酶1 μl，反應(yīng)總體積20 μl，37℃酶切30 min后終止。用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并于凝膠成像儀下觀察酶切結(jié)果。

2結(jié)果

正常情況下241 bp的PCR擴(kuò)增片段中不存在Hind Ⅲ內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，即野生型。若FVL基因發(fā)生A→G突變，則出現(xiàn)一個(gè)Hind Ⅲ內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，其中241 bp片段被切成209 bp、32 bp 2個(gè)片段。若為突變純合子，酶切后出現(xiàn)209 bp、32 bp二條電泳條帶；若為突變雜合子，酶切后出現(xiàn)241 bp、209 bp、32 bp三條電泳條帶。本實(shí)驗(yàn)167例冠心病患者人群中FVLeiden基因均無(wú)該突變類(lèi)型，均為野生型，其PCR產(chǎn)物和酶切后的產(chǎn)物大小均為241 bp，不存在Hind Ⅲ內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

同樣，對(duì)健康人群的PCR產(chǎn)物以及經(jīng)Hind Ⅲ限制性核酸內(nèi)切酶酶切后的電泳圖表明69例健康人群的FVLeiden也未發(fā)生突變，同老年冠心病人群沒(méi)有差異。見(jiàn)圖2。

老年冠心病人群FVLeiden基因突變的發(fā)生率也為0%，均為野生型，與漢族健康人群的FVLeiden基因無(wú)明顯差異。

1～5：老年冠心病人群PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；6～10：老年冠心病人群PCR酶切產(chǎn)物；M為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker 圖1　老年冠心病人群PCR產(chǎn)物及Hind Ⅲ內(nèi)切酶酶切 凝膠電泳

1～5：健康人群PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；6～10：健康人群PCR酶切產(chǎn)物；M為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker 圖2　健康人群PCR產(chǎn)物及Hind Ⅲ內(nèi)切酶酶切 凝膠電泳

3討論

關(guān)于FVLeiden基因突變的報(bào)道很多，由于研究方法的差異和樣本含量不同等原因，結(jié)果也不盡相同。Bertina等〔5〕發(fā)現(xiàn)，64例有APC-R現(xiàn)象的血栓形成患者中，56例攜帶有FVLeiden突變的等位基因。在60歲以上有冠心病史的男性患者中，該等位基因的檢出率為25.8% 。隨后，他們?cè)趯?duì)77例冠心病患者的隨訪調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，攜帶者復(fù)發(fā)的可能性比未攜帶者多2～3倍。

高麗霞等〔6〕認(rèn)為APC-R現(xiàn)象在新疆地區(qū)少數(shù)民族健康者中中有較高的發(fā)生率，其分布與人種、地域有關(guān)。本研究結(jié)果提示FVLeiden突變可能不是我國(guó)健康人群以及冠心病患者發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素。

4參考文獻(xiàn)

1Dahlback B，Carlsson M，Svensson PJ.Familial thrombophilia due to a previously uncognised mechanism characterized by poor anticoagulantresponse to activated protein C：prediction of a cofactor to activated protein〔J〕.Proc Nat Acad Sci，1993；90(3)：1004-8.

2Bertina RM，Koeleman PC，Koster T，etal.Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C〔J〕.Nature，1994；369(6475)：64-7.

3王秉林，戈小虎.FV Leiden 與FⅡG20210A 突變?cè)诓煌N族人群易栓癥中表達(dá)的研究現(xiàn)狀〔J〕.中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2012；19(7)：793-5.

4Huber S，McMaster KJ，Voelkerding KV.Analytical evaluation of primer engineered multiplex polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism for detection of factor V leiden and prothrombin G20210A〔J〕.J Mol Diagn，2000；2(3)：153-7.

5Bertina RM.Factor V.Leiden and other coagulation factor mutations affecting thrombotic risk〔J〕.Clin Chem，1997；43(9)：1678-83.

6高麗霞，哈力達(dá)·亞森，許風(fēng)雷，等.新疆地區(qū)動(dòng)脈血栓形成患者抗活化蛋白C及FVLeiden 突變的調(diào)查〔J〕.血栓與止血學(xué)，2007；13(4)：161-3.

〔2013-11-21修回〕

(編輯袁左鳴)