同源異型盒基因在膠質(zhì)瘤細胞增殖及遷移侵襲中的作用

劉鵬冉雯雯1吳澤玉2倫鵬2孟慶海1

(青島市黃島區(qū)第二人民醫(yī)院，山東青島266400)

摘要〔〕目的研究同源異型盒基因(HOXA5)在膠質(zhì)瘤增殖及遷移侵襲中的作用。方法采用shRNA干擾技術(shù)構(gòu)建HOXA5低表達膠質(zhì)瘤細胞系，通過MTT，Transwell和Matrigel方法研究干擾HOXA5表達后對膠質(zhì)瘤細胞增殖和侵襲遷移的影響。結(jié)果與對照組細胞相比，干擾HOXA5表達后能夠顯著抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖和運動侵襲能力(P<0.01)。結(jié)論HOXA5可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，其機制與促進細胞的增殖和侵襲遷移有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕膠質(zhì)瘤；同源異型盒基因A5；細胞增殖；細胞遷移

中圖分類號〔〕R739.4〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：青島市醫(yī)療衛(wèi)生優(yōu)秀人才培養(yǎng)項目資助(2015)

通訊作者：孟慶海(1950-)，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導師，主要從事腦腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。

1青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科

2青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科

第一作者：劉鵬(1980-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事腦腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。

腫瘤呈多因素誘導、多基因參與、多階段發(fā)生的極其復雜的病理過程，癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活是人類腫瘤形成和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)〔1〕。腫瘤的發(fā)生似乎重現(xiàn)了胚胎早期發(fā)育及胚胎畸變的過程，調(diào)控細胞發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子，同源異型盒基因(HOXA5)就是其中具有代表性的一個。HOXA5基因的異常表達在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其該作用可能通過參與細胞周期和(或)細胞凋亡調(diào)控而實現(xiàn)〔2～4〕。研究顯示，在白血病、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌等多種腫瘤中已檢測到HOXA5的異常表達〔5～8〕。HOXA5的異常表達已被證實與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但在膠質(zhì)瘤中作用尚不清楚。本研究擬應用體外培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細胞系，通過RNA干擾技術(shù)研究HOXA5在膠質(zhì)瘤中的作用及可能的分子機制。

1材料與方法

1.1細胞和抗體膠質(zhì)瘤細胞系U87、U373、U251、T98G、SW1088購于武漢大學中國典型保藏中心，細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2，每2 d換液1次，細胞長至80%時進行傳代及實驗。HOXA5和β-acitn的抗體均購自CST。

1.2HOXA5干擾質(zhì)粒及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒細胞系的構(gòu)建根據(jù)pSuper質(zhì)粒說明書的要求，設(shè)計兩個與HOXA5 mRNA配對的核苷酸序列，通過華大公司合成后，退火，克隆至pSuper質(zhì)粒的相應位點，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，小提后測序驗證分別命名為pSuper shHOXA5A和pSuper shHOXA5B。應用逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞Phinex，包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒后感染U251細胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株，經(jīng)Western印跡和RT-PCR檢測對HOXA5干擾效果后應用于后續(xù)實驗。

1.3RT-PCR常規(guī)按照Trizol試劑說明書提取細胞總的mRNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度后進行逆轉(zhuǎn)錄反應成cDNA。應用PCR試劑盒擴增檢測HOXA5的表達，并用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.4Western印跡提取細胞裂解液，蛋白濃度測定后通過10% 的SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜后封閉2 h，分別應用相應的一抗孵育過夜后，TBST洗3次，每次10 min，室溫下加入相應二抗孵育1 h，洗滌后應用ECL化學發(fā)光反應，然后顯影、定影。膠片掃描后應用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析條帶的光密度值。

1.5激光共聚焦檢測細胞免疫熒光染色細胞爬片后甲醛固定，3%H2O2孵育10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，封閉后一抗4℃過夜，PBS沖洗后加入熒光標記的二抗室溫孵育1 h，PBS沖洗后，DAPI復染細胞核，PBS沖洗后封片，Zeiss 7800激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光強度變化。

1.6MTT實驗取對數(shù)生長期的對照組和實驗組的細胞，用0.25%的胰酶常規(guī)消化，計數(shù)，用含有10%FBS的培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞密度為2×104/ml，分別接種到96孔板中，100 μl/孔，每組設(shè)6個復孔；另外設(shè)置調(diào)零孔：含有10%FBS的培養(yǎng)基，100 μl/孔；將96孔板置于CO2培養(yǎng)箱，在37℃，5% CO2及飽和濕度環(huán)境下，分別培養(yǎng)1，2，3，4 d后，每孔加入10 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)；將上清去掉，每孔加入150 μl DMSO溶液，置于搖床上低速震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；在酶聯(lián)免疫檢測儀上，OD值570nm處測量各孔的吸光值。

1.7細胞遷移與侵襲實驗遷移實驗：細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化細胞，用D-Hanks和無血清培養(yǎng)基先后洗滌一次，用無血清培養(yǎng)基懸浮細胞，計數(shù)，調(diào)整濃度為2×105/ml；在Transwell的下室(即24孔板底部)加入800 μl含10%血清的培養(yǎng)基，上室加入100 μl細胞懸液，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)48 h；用鑷子小心取出chamber，吸干上室液體，移到預先加入約800 μl甲醇的孔中，室溫固定30 min；取出chamber，吸干上室固定液，移到預先加入約800 μl Giemsa染液的孔中，室溫染色30 min；在清水浸泡數(shù)次，取出chamber，吸干上室液體，用濕棉棒小心擦拭上室底部膜表面上的細胞；小心地用鑷子揭下膜，底面向上晾干，用中性樹膠將膜封片在載玻片上；于光學顯微鏡下計數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果。侵襲實驗：在Transwell小室的上室底部中央垂直加入50 μl稀釋后的Matrigel膠，其余操作過程同遷移實驗。

1.8統(tǒng)計學方法應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件行單因素方差分析及t檢驗。

2結(jié)果

2.1膠質(zhì)瘤細胞中HOXA5的表達Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)，相對于大鼠的正常腦組織中的低表達狀態(tài)，在5種膠質(zhì)瘤細胞株中HOXA5的表達呈不同程度的高表達，其中惡性侵襲程度高的膠質(zhì)瘤細胞U87和U251中表達顯著增高。見圖1。

2.2shRNA干擾HOXA5的U251細胞系的構(gòu)建各種方法證實pSuper-shHOXA5A和pSuper-shHOXA5B在蛋白和mRNA水平分別不同程度地干擾掉HOXA5的表達。見圖2。

2.3干擾HOXA5后U251細胞增殖能力降低MTT結(jié)果顯示，相對于對照組細胞(pSuper)，shRNA干擾HOXA5表達后的U251細胞組(pSuper-shHOXA5A和pSuper-shHOXA5B)在48 h、72 h和96 h的細胞增殖能力顯著降低，表明干擾HOXA5表達能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力。見表1。

圖1　Western印跡檢測正常腦組織和膠質(zhì)瘤細胞株中 HOXA5的表達

1：空載體；2：shHOXA5A；3：shHOXA58 Western印跡檢測

1：空載體；2：shHOXA5A；3：shHOXA58 RT-PCR檢測

免疫熒光染色

組別0p4p8h72h96h空載體0.31±0.050.43±0.070.61±0.090.71±0.060.84±0.07pSupershHOXA5A0.29±0.030.41±0.020.43±0.060.45±0.020.50±0.03pSupershHOXA5B0.32±0.060.38±0.050.42±0.070.47±0.030.51±0.02

2.4干擾HOXA5后U251細胞遷移和侵襲能力降低見圖3。Transwell實驗和Matrigel實驗分別檢測細胞的遷移和侵襲能力，結(jié)果表明：相對于對照組U251細胞(pSuper)遷移(53±4)和侵襲能力(37±6)，干擾HOXA5后的U251細胞(pSuper-shHOXA5A和pSuper-shHOXA5B)的遷移(19±3，22±3)和侵襲能力(17±2，19±3)均不同程度的降低(P<0.01)，表明干擾HOXA5能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞的運動和侵襲能力。

圖3　實驗細胞的遷移和侵襲能力檢測(200×)

3討論

HOXA5基因的表達與腫瘤的相關(guān)性具有自身的特點：在組織器官正常發(fā)育與腫瘤的發(fā)生過程中HOXA5基因的表達不盡相同；HOXA5基因可能與家族成員之間可能存在一種協(xié)同調(diào)控的網(wǎng)絡機制；HOXA5基因的表達與細胞因子、生長因子和激素之間存在相互作用；HOXA5基因可以影響正常細胞周期，參與細胞周期"檢查點"的調(diào)控；此外HOXA5可能通過調(diào)節(jié)細胞凋亡而發(fā)揮作用〔9〕。本研究在體外初步研究了HOXA5在膠質(zhì)瘤細胞的表達以及對膠質(zhì)瘤細胞增殖和運動侵襲能力的影響，為深入研究HOXA5在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用和分子機制提供一定基礎(chǔ)。在膠質(zhì)瘤細胞系中HOXA5表達升高，表明HOXA5可能與膠質(zhì)瘤具有一定的相關(guān)性，可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用。細胞增殖能力增強是惡性膠質(zhì)瘤體積擴增的主要原因之一，本研究提示膠質(zhì)瘤細胞中高表達的HOXA5可能具有促進膠質(zhì)瘤細胞增殖的能力。膠質(zhì)瘤的局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移是其惡性程度的標志之一〔10〕，本研究表明高表達的HOXA5對膠質(zhì)瘤細胞的運動和侵襲能力具重要的調(diào)控作用。

4參考文獻

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〔2014-05-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)