苯腎上腺素對低氧肺損傷大鼠肺泡液體清除的作用

李乃靜谷秀1李偉2何平李勝岐1

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院老年科，遼寧沈陽110000)

摘要〔〕目的探討α腎上腺素能受體激動(dòng)劑苯腎上腺素對低氧肺損傷大鼠肺泡液體清除率(AFC)的作用及機(jī)制。方法低氧大鼠暴露于10%的氧濃度,分別于24 h和48 h測定AFC、總肺水量(TLW)。苯腎上腺素分別與α1受體阻滯劑哌唑嗪、α2受體阻滯劑育亨賓、β1受體阻滯劑阿替洛爾、β2受體阻滯劑ICI-118551、鈉通道阻斷劑氨氯吡咪及Na+-K+-ATP酶阻斷劑哇巴因混合后灌注到低氧48 h大鼠的肺泡腔內(nèi),測定AFC的變化。結(jié)果大鼠暴露于10%的氧濃度24 h后AFC(17.09±2.36)%/h與正常大鼠AFC(16.85±2.87)%/h比較沒有明顯變化; 48 h時(shí)AFC(8.41±2.67)%/h明顯降低。苯腎上腺素能明顯增加低氧大鼠AFC。苯腎上腺素增加低氧大鼠AFC的作用能夠被哌唑嗪、阿替洛爾、ICI-118551、氨氯吡咪和哇巴因抑制。結(jié)論α腎上腺素能受體激動(dòng)劑苯腎上腺素通過調(diào)節(jié)Na+-K+-ATP酶及鈉通道的活性增加低氧肺損傷大鼠肺泡液體清除能力,促進(jìn)肺水腫液的吸收。

關(guān)鍵詞〔〕低氧; 腎上腺素能受體激動(dòng)劑; 肺水腫

中圖分類號(hào)〔〕R965.2〔

基金項(xiàng)目：遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(201202245)；教育部留學(xué)回國人員科研啟動(dòng)基金(教外司留1139)

1中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院2沈陽藥科大學(xué)藥物分析教研室

第一作者：李乃靜(1972-)，女，博士，副教授，主要從事老年呼吸系統(tǒng)疾病研究。

肺泡上皮細(xì)胞的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)功能對于清除肺泡腔內(nèi)的液體，保持肺泡干燥及進(jìn)行有效的氣體交換起著至關(guān)重要的作用。很多因素都可以對肺泡液體清除率(AFC)產(chǎn)生影響，其中以β腎上腺素能受體激動(dòng)劑對的影響報(bào)道最多，β1、β2和β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑都可以提高〔1,2〕。肺泡上皮還同時(shí)存在α腎上腺素能受體激動(dòng)劑，有關(guān)肺損傷情況下α腎上腺素能受體激動(dòng)劑對肺泡腔內(nèi)液體的清除作用鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立低氧肺損傷大鼠動(dòng)物模型，考察α腎上腺素能受體激動(dòng)劑對肺損傷后肺水腫的改善作用。

1材料和方法

1.1材料雄性Wistar大鼠體重300～330 g,由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。α受體激動(dòng)劑苯腎上腺素、α1受體阻滯劑哌唑嗪、α2受體阻滯劑育亨賓、β1受體阻滯劑阿替洛爾、β2受體阻滯劑ICI-118551、鈉通道阻斷劑氨氯吡咪、Na+-K+-ATP酶阻斷劑哇巴因、秋水仙堿及β光秋水仙堿購于Sigma公司。

1.2方法

1.2.1低氧肺損傷大鼠動(dòng)物模型的制備〔3〕大鼠置于密閉容器中(15 cm×10 cm×8 cm) ，以2～3 L/min輸入氮氧混合氣,用數(shù)字式測氧儀(浙江省建德市利達(dá)儀器廠)監(jiān)測箱內(nèi)氧濃度,使氧濃度維持在(10±1)%。用鈣石灰吸收CO2,使其濃度小于0.5%，溫度25℃～26℃，濕度60.0%～70.0%，大鼠自由攝取食物和水。選取低氧吸入48 h的大鼠作為研究對象。正常對照組大鼠置于室內(nèi)空氣中，氧濃度21.0%，飼養(yǎng)條件與低氧組相同。

1.2.2分組將動(dòng)物隨機(jī)分組，每組動(dòng)物10只，共16組。①低氧對大鼠AFC的影響分別測定低氧24、48 h大鼠及正常對照組大鼠總肺水量(TLW)、AFC，并取肺組織進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察。部分肺組織浸入4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色，普通光鏡觀察肺組織形態(tài)；部分肺組織放入2.5%戊二醛內(nèi)固定，經(jīng)0.1 mol/L磷酸緩沖液浸洗后，1%四氧化鋨酸固定，磷酸緩沖液浸洗，置乙醇中梯度脫水，環(huán)氧丙烷置換，環(huán)氧樹脂618包埋，超薄切片經(jīng)醋酸鈾檸檬酸鉛染色后，透射電鏡下觀察肺組織形態(tài)。②α受體激動(dòng)劑苯腎上腺素對低氧大鼠AFC的作用 將10-9、 10-8、10-7、 10-6及 10-5mol/L苯腎上腺素的5%白蛋白等滲生理鹽水溶液，以5 ml/kg灌注到低氧48 h大鼠的肺臟。③α受體阻滯劑對苯腎上腺素作用的影響：將10-5mol/L苯腎上腺素的5%白蛋白等滲生理鹽水溶液分別與α1受體阻滯劑10-4mol/L哌唑嗪和α2受體阻滯劑10-4mol/L育亨賓混合，再灌注到低氧48 h大鼠的肺臟。④β受體阻滯劑對苯腎上腺素作用的影響將10-5mol/L苯腎上腺素的5%白蛋白等滲生理鹽水溶液分別與β1受體阻滯劑10-5mol/L阿替洛爾和β2受體阻滯劑10-5mol/L ICI118551混合,再灌注到低氧48 h大鼠的肺臟。⑤鈉通道阻斷劑及Na+-K+-ATP酶阻斷劑對苯腎上腺素作用的影響 將10-5mol/L苯腎上腺素的5%白蛋白等滲生理鹽水溶液分別與鈉通道阻斷劑5×10-4mol/L氨氯吡咪和Na+-K+-ATP酶阻斷劑5×10-4mol/L哇巴因混合,再灌注到低氧48 h大鼠的肺臟。⑥細(xì)胞微管系統(tǒng)對苯腎上腺素作用的影響 將10-5mol/L苯腎上腺素的5%白蛋白等滲生理鹽水溶液灌注到低氧48 h大鼠的肺臟。灌注前15 h大鼠腹腔注射秋水仙堿(0.25 mg/100 g體重)，對照組大鼠腹腔注射β光秋水仙堿(0.25 mg/100 g體重)。β光秋水仙堿是秋水仙堿的異構(gòu)體，它具有與秋水仙堿相似的化學(xué)特性，但不具有秋水仙堿破壞細(xì)胞內(nèi)微管系統(tǒng)的特點(diǎn)。

1.2.3 指標(biāo)測定①AFC的測定：將大鼠用10%水合氯醛3 ml/mg腹腔麻醉，氣管切開后進(jìn)行氣管插管。腹主動(dòng)脈放血處死大鼠，將氣管、肺臟、心臟全部取出。用保鮮膜包被后放入37℃水浴箱中孵育。通過氣管導(dǎo)管將Evens藍(lán)(0.15 g/L)標(biāo)記的5%白蛋白等滲生理鹽水溶液以5 ml/kg灌入大鼠氣管內(nèi)。并給予4 ml的氮?dú)庖源_保灌注液到達(dá)肺臟。并且持續(xù)給予10%的氧氣，使氣道內(nèi)保持7 cmH2O的氣道壓力，孵育1 h后通過分光光度儀，在波長620 nm處測定Evens藍(lán)標(biāo)記的白蛋白濃度。AFC計(jì)算公式如下〔1〕: AFC(%)=(Vi-Vf)/ Vi×100,Vf=Vi×Pi/ Pf,式中Vi和Vf分別代表起始和最終肺泡液體總量，i表示灌注前，f表示孵育1 h后吸出的肺泡灌洗液體積。P是Evens藍(lán)標(biāo)記的白蛋白濃度。②TLW測定：采用Noble法并加以改動(dòng)〔4〕,公式: TLW=(肺濕重-肺干重)/肺干重。

2結(jié)果

2.1正常對照組及低氧大鼠病理表現(xiàn)及TLW及AFC基礎(chǔ)值正常對照組大鼠的肺泡腔基本干燥，肺間質(zhì)無水腫，肺泡周圍血管無擴(kuò)張、充血;肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。低氧48 h大鼠可見到肺間質(zhì)增寬、淤血,并有肺出血及水腫;肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞纖毛倒伏，板層小體結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞質(zhì)水腫，見圖1。TLW隨著低氧暴露時(shí)間的延長而增加(24 h：3.52±0.27;48 h:4.36±0.18),與正常對照組(2.96±0.14)差異顯著(P<0.05);低氧24 h大鼠AFC(16.85±2.87)與正常對照組(17.09±2.36)比較無明顯差異(P>0.05) ，低氧48 h大鼠AFC(8.41±2.67)明顯低于正常對照組(P<0.05)(表1)。

圖1　各組大鼠肺泡及肺泡上皮細(xì)胞(HE)

組別正常對照組低氧24h低氧48hTLW(g/g)2.96±0.143.52±0.271)4.36±0.191)AFC(%/h)17.09±2.3616.85±2.878.41±2.671)

與正常對照組比較：1)P<0.05

2.2苯腎上腺素對低氧48 h大鼠AFC的作用10-9mol/L苯腎上腺素作用后低氧48 h大鼠AFC未見明顯改變〔(9.26±1.85)%〕；10-8、10-7、10-6及 10-5mol/L苯腎上腺素作用后低氧48 h大鼠AFC明顯升高〔(12.74±2.62)、(13.68±3.07)、(13.06±2.21)(15.22±2.35)%/h，P<0.05〕。

2.3藥物對苯腎上腺素作用的影響苯腎上腺素分別與α1受體阻滯劑哌唑嗪〔(10.50±1.85)%/h〕、β1受體阻滯劑阿替洛爾〔(12.10±1.07)%/h〕、β2受體阻滯劑ICI-118551〔(12.98±2.60)%/h〕、鈉通道阻斷劑氨氯吡咪〔(11.16±3.25)%/h〕和Na+-K+-ATP酶阻斷劑哇巴因〔(9.0±3.39)%/h〕混合作用于低氧48 h大鼠,其AFC顯著低于相同濃度苯腎上腺素單獨(dú)作用(P<0.05); 苯腎上腺素與α2受體阻滯劑育亨賓〔(15.16±2.79)%/h〕混合作用于低氧48 h大鼠,其AFC與相同濃度苯腎上腺素單獨(dú)作用比較無顯著性差異(P>0.05)，苯腎上腺素明顯高于低氧48 h大鼠基礎(chǔ)AFC(P<0.05)。經(jīng)秋水仙堿〔(14.16±3.79)%/h〕預(yù)處理后，苯腎上腺素對低氧48 h 大鼠AFC的作用明顯降低；經(jīng)β光秋水仙堿預(yù)處理后，苯腎上腺素對低氧48 h 大鼠AFC的作用無明顯差異。

3討論

關(guān)于β受體激動(dòng)劑，尤其是β2受體激動(dòng)劑對肺泡上皮液體轉(zhuǎn)運(yùn)功能的調(diào)節(jié)作用已經(jīng)很明確〔1〕，但有關(guān)α腎上腺素能受體激動(dòng)劑對肺損傷后AFC的影響鮮見報(bào)道。低氧肺損傷常見于多種嚴(yán)重的心肺疾患，是呼吸科常見危重癥之一。低氧肺損傷的程度與氧氣的濃度及低氧的持續(xù)時(shí)間有關(guān)〔4〕。本實(shí)驗(yàn)提示肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性是維持肺泡液體主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)〔4〕。

本試驗(yàn)結(jié)果表明α腎上腺素能受體激動(dòng)劑苯腎上腺素對肺泡液體清除率的調(diào)節(jié)呈現(xiàn)劑量依賴性。選擇性α1腎上腺素能受體阻滯劑哌唑嗪、β1受體阻滯劑阿替洛爾、β2受體阻滯劑ICI-118551能顯著地抑制苯腎上腺素對肺泡液體清除率的改善作用，但α2腎上腺素能受體阻滯劑育亨賓則對苯腎上腺素的改善肺泡液體清除率的作用沒有影響。苯腎上腺素對肺泡液體清除率的改善作用是α1、β1和β2腎上腺素能受體共同介導(dǎo)的。10%氧氣48 h尚不至于對肺泡上皮細(xì)胞造成不可逆的損傷，同時(shí)也說明在輕、中度肺損傷時(shí)，肺泡上皮細(xì)胞腎上腺素能受體并沒有遭到破壞〔5〕。肺泡上皮細(xì)胞鈉的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)由鈉通道和Na+-K+-ATP酶共同完成〔6,7〕。本實(shí)驗(yàn)說明苯腎上腺素通過調(diào)節(jié)肺泡上皮鈉主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)功能，加速肺水腫液的吸收。氨氯吡咪降低了27%苯腎上腺素對低氧大鼠肺泡液體清除率的作用，哇巴因降低了41%苯腎上腺素對低氧大鼠的作用。氨氯吡咪敏感性鈉通道在人和大鼠占40%～50%,而在兔和小鼠大于80%〔8〕，因而在人類非氨氯吡咪敏感性鈉通道所起的作用是不容忽略的。秋水仙堿能夠破壞細(xì)胞內(nèi)的微管系統(tǒng)，從而抑制Na+-K+-ATP酶在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移而發(fā)揮作用。β光秋水仙堿是秋水仙堿的異構(gòu)體，具有秋水仙堿相似的特性，但它不與細(xì)胞內(nèi)的微管蛋白結(jié)合，因而不能抑制Na+-K+-ATP酶在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移〔9〕。本實(shí)驗(yàn)說明苯腎上腺素提高AFC的作用，與其促進(jìn)Na+-K+-ATP酶在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移有關(guān)。

α腎上腺素能受體激動(dòng)劑苯腎上腺素能夠提高AFC，減輕肺水腫的作用是肯定的。研制減輕該類藥物副作用的新型復(fù)合產(chǎn)品或探討有效作用于肺部、避免全身副作用的最佳藥物濃度將為臨床治療肺水腫提供更多的選擇方法。

4參考文獻(xiàn)

1Sakuma T,Tsukano C,Ishigaki M,etal.Lung deflation impairs alveolar epithelial fluid transport in ischemic rabbit and rat lungs〔J〕.Transplantation,2000;69(3): 1785-92.

2谷秀，李勝岐，佐久間勉.β腎上腺素能受體激動(dòng)劑對離體大鼠肺泡液體清除率的作用〔J〕.中華結(jié)核和呼吸雜志，2005；28(6): 390-3.

3李乃靜，谷秀，李偉，等.地諾帕明對低氧肺損傷大鼠肺泡液體清除的作用〔J〕.中國病理生理雜志，2008；24(4): 670-3.

4Song W,Wei S,Matalon S.Inhibition of epithelial sodium channels by respiratory syncytial virus in vitro and in vivo 〔J〕.Ann N Y Acad Sci,2010;1023(8): 79-84.

5Berthiaume Y,Folkesson HG,Matthay MA.Lung edema clearance: 20 years of progress〔J〕.J Appl Physiol,2002;93(6): 2207-13.

6Deng J，Wang DX，Deng W,etal.Regulation of alveolar fluid clearance and EnaC expression in lung by exogenous angiotensin II〔J〕.Respir Physiol Neurobil,2011;181(1): 53-61.

7Bastarache JA,Ong T,Matthay MA,etal.Alveolar fluid clearance is faster in women with acute lung injury compared to men〔J〕.J Crit Care,2011;26(3): 249-56.

8Dada IA,Sznajder JI.Mechanisms of pulmonary edema clearance during acute hypeoxemic respiratory failure :role of the Na-K-ATPase〔J〕.Crit Care Med,2003;6(12):S248-52.

9Saldias FJ,Comellas AP,Pesce L,etal.Dopamine increases lung liquid clearance during mechanical ventilation〔J〕. Am J Respir Crit Care Med,2002;22(166): L136-43.

〔2013-08-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)