蔡國徽，韓云竹，唐斌，宋鴻

（遵義醫(yī)學院微生物學教研室，貴州遵義563099）

膠原三維培養(yǎng)下卵巢癌細胞生物學性狀研究

蔡國徽，韓云竹，唐斌，宋鴻

（遵義醫(yī)學院微生物學教研室，貴州遵義563099）

目的建立卵巢癌HO-8910PM細胞膠原Ⅰ三維培養(yǎng)模型，對膠原Ⅰ基質(zhì)中卵巢癌HO-8910PM細胞的形態(tài)、活力及功能進行研究，為體外卵巢癌的研究提供參考。方法透射電鏡表征膠原Ⅰ結(jié)構(gòu)特點，以膠原Ⅰ為支架材料，建立卵巢癌細胞體外三維培養(yǎng)模型；倒置顯微鏡觀察卵巢癌細胞生長形態(tài)及增殖情況；鈣黃綠素-AM染色觀察膠原Ⅰ基質(zhì)中卵巢癌細胞的活力；ELISA檢測二維培養(yǎng)及三維培養(yǎng)中卵巢癌細胞血管內(nèi)皮生長因子-A（VEGF-A）、表皮生長因子（EGF）和胰島素樣生長因子-1（IGF-1）的分泌。結(jié)果透射電鏡下可見膠原Ⅰ呈交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，膠原Ⅰ基質(zhì)中卵巢癌細胞集聚成不規(guī)則團狀，細胞在膠原Ⅰ中的活力較好，細胞與基質(zhì)具有良好的生物相容性；與二維培養(yǎng)細胞比較，三維培養(yǎng)體系中VEGF-A、EGF和IGF-1的分泌量均較高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或0.01）。結(jié)論膠原Ⅰ具有良好的結(jié)構(gòu)與性能，適宜于卵巢癌細胞體外三維培養(yǎng)，并能較好地維持卵巢癌細胞的形態(tài)和功能。

卵巢腫瘤；培養(yǎng)技術(shù)；膠原Ⅰ型；血管內(nèi)皮生長因子類；表皮生長因子

在全球范圍內(nèi)，卵巢癌的發(fā)病率在女性惡性腫瘤中占3%～4%，但病死率卻居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第1位[1-2]。因此，研究卵巢癌發(fā)生發(fā)展機制，對于提高卵巢癌患者臨床治療效果尤為重要。目前，卵巢癌的體外研究大多采用二維細胞培養(yǎng)模式，但由于培養(yǎng)裝置常為玻璃或塑料的二維平面，無法模擬具有空間結(jié)構(gòu)的細胞外基質(zhì)（ECM）與細胞之間的相互作用。有研究發(fā)現(xiàn)，二維細胞培養(yǎng)使細胞處于二維平面上，常導致細胞部分生物學特性的改變，甚至一些關(guān)鍵的細胞表型及功能缺失[3]。因此，二維培養(yǎng)模型中的細胞生物學過程并不能反映細胞在體內(nèi)的真實行為，更無法體現(xiàn)三維微環(huán)境中多種信號對細胞的調(diào)節(jié)作用。動物模型雖可以模擬體內(nèi)腫瘤細胞生長的微環(huán)境，但難以進行大規(guī)模的分子水平研究?，F(xiàn)有研究表明，三維培養(yǎng)的肺癌細胞間相互連接緊密，可較好地實現(xiàn)細胞間信號傳導，細胞在分化程度、超微結(jié)構(gòu)等方面也與體內(nèi)細胞更為接近[4]。三維細胞培養(yǎng)體系彌補了二維培養(yǎng)與動物實驗的不足，將細胞、人造基質(zhì)骨架及各種因子共培養(yǎng)，不僅為腫瘤細胞生長提供了類似于體內(nèi)ECM的支架或基質(zhì)結(jié)構(gòu)，還可實現(xiàn)細胞間、細胞與ECM間的相互作用，也更能反映細胞與細胞間質(zhì)間的作用機制，有利于從分子水平對腫瘤相關(guān)機制進行研究。本研究采用膠原Ⅰ建立卵巢癌HO-8910PM細胞三維培養(yǎng)模型，對三維培養(yǎng)和二維培養(yǎng)下卵巢癌細胞的形態(tài)及血管內(nèi)皮生長因子-A（VEGF-A）、表皮生長因子（EGF）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）的分泌進行對比分析，為今后體外研究卵巢癌的發(fā)生機制提供實驗基礎(chǔ)及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料鼠尾膠原Ⅰ購自美國BD公司，鈣黃綠素-AM購自美國Sigma公司。細胞培養(yǎng)用PRMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）均購自美國Gibco公司，0.25%Trypsin-EDTA、雙抗（100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素）均購自美國Hyclone公司，VEGF-A、EGF和IGF-1 ELISA檢測試劑盒均購自美國Uscn公司。3131型CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，318C酶標儀購自上海三科儀器有限公司，IX71型熒光倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，H-7650型透射電鏡購自日本Hitachi公司。

1.2 方法

1.2.1 透射電鏡表征膠原結(jié)構(gòu)特點PBS稀釋膠原Ⅰ至濃度為0.06 mg/mL，取少量滴在透射電鏡專用銅格上，5 min后用濾紙吸掉銅格上的液體，滴加1%磷鎢酸負染30 s，濾紙吸掉銅格上多余的磷鎢酸，室溫晾干，透射電鏡觀察并拍照。

1.2.2 細胞培養(yǎng)HO-8910PM細胞株來自ATCC（美國模式培養(yǎng)物集存庫），含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素雙抗的PRMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2及飽和濕度常規(guī)培養(yǎng)，待細胞融合至80%時，0.25%Trypsin-EDTA消化細胞進行下一步實驗。

1.2.3 三維培養(yǎng)取生長狀態(tài)良好的二維培養(yǎng)細胞，0.25%Trypsin-EDTA消化，冰浴下按照說明書以1 mol/L NaOH溶液和0.1 mol/L PBS調(diào)整膠原Ⅰ的pH值為中性，與細胞混勻，使得膠原Ⅰ終濃度為1.5 mg/mL，細胞終濃度為1×106mL-1，混合后取100 μL快速接種于24孔板內(nèi)，37℃孵育30min后，加入800μL完全PRMI-1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2及飽和濕度常規(guī)培養(yǎng)，隔天換液，并于倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。

1.2.4 鈣黃綠素-AM染色細胞在膠原Ⅰ中培養(yǎng)3、6 d，預(yù)冷的PBS洗3次，每次15 min，以去除或稀釋血清中的酯酶活性。PBS稀釋鈣黃綠素-AM液至2 μmol/L，取300 μL添加到三維培養(yǎng)凝膠中，室溫孵育45 min，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 VEGF-A、EGF和IGF-1的分泌膠原Ⅰ三維培養(yǎng)卵巢癌細胞，到第4天時更換培養(yǎng)液，每孔加800 μL完全PRMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)到第6天，取出細胞培養(yǎng)液，2 000 g離心20 min，取上清液分裝于1.5 mL EP管中備用。樣本處理按照ELISA試劑盒說明書進行，酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度值，并與二維培養(yǎng)細胞作對比。

1.3 統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用±s表示，采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 透射電鏡下膠原Ⅰ結(jié)構(gòu)特點透射電鏡下可見膠原Ⅰ呈細長交叉的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，這種交叉的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)為腫瘤細胞三維培養(yǎng)提供了一個類似細胞外基質(zhì)的支架結(jié)構(gòu)。見圖1。

圖1 透射電鏡膠原Ⅰ在PBS中溶解后的結(jié)構(gòu)特點

2.2 膠原Ⅰ基質(zhì)中細胞的形態(tài)倒置顯微鏡下可見二維培養(yǎng)下的卵巢癌HO-8910PM細胞形態(tài)與膠原Ⅰ基質(zhì)中的生長形態(tài)完全不同：二維培養(yǎng)條件下卵巢癌細胞呈多邊形，培養(yǎng)4 h開始貼壁，24 h完全貼壁；然而，在膠原Ⅰ基質(zhì)中，細胞均勻分布于基質(zhì)材料中，培養(yǎng)第3天時細胞開始形成明顯的不規(guī)則狀細胞團，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞團逐漸增大。見圖2。

圖2 卵巢癌HO-8910PM細胞二維培養(yǎng)及膠原Ⅰ中三維培養(yǎng)3、6 d的形態(tài)（100×）

2.3 細胞存活力觀察膠原Ⅰ基質(zhì)中細胞分別培養(yǎng)到第3、6天時進行鈣黃綠素染色可見：處于不同梯度的細胞均呈現(xiàn)綠色熒光，細胞呈不規(guī)則團狀集聚，見圖3。生長于膠原Ⅰ基質(zhì)中的卵巢癌細胞基本存活，生長狀態(tài)較好，細胞與膠原Ⅰ具有良好的生物相容性。

圖3 HO-8910PM細胞在膠原Ⅰ中三維培養(yǎng)第3天和第6天的鈣黃綠素熒光染色圖（100×）

2.4 2種培養(yǎng)方法卵巢癌細胞VEGF-A、EGF和IGF-1分泌量比較與二維培養(yǎng)細胞比較，膠原Ⅰ三維培養(yǎng)體系中VEGF-A、IGF-1和EGF的分泌量顯著增高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或0.01）。見表1。

表1 2種培養(yǎng)方法卵巢癌細胞VEGF-A、EGF和IGF1分泌量比較（±s，pg/mL）

表1 2種培養(yǎng)方法卵巢癌細胞VEGF-A、EGF和IGF1分泌量比較（±s，pg/mL）

組別二維培養(yǎng)三維培養(yǎng)VEGF-AEGF IGF-1 tP 41.752 8±1.974 1 77.137 0±0.964 6 27.894＜0.01 5.420 5±0.502 9 7.254 7±0.532 9 4.335＜0.05 1 951.793 0±113.945 2 5 162.465 0±287.414 9 17.987＜0.01

3 討論

近年來，越來越多的研究表明，三維培養(yǎng)比二維培養(yǎng)更能真實地反映細胞在體內(nèi)的生物學行為[5]。為建立更為理想的細胞體外三維培養(yǎng)模型，多種材料被用于構(gòu)建類似體內(nèi)的微環(huán)境，主要有高分子聚合材料、有機材料復(fù)合物和細胞外基質(zhì)等[6]。高分子聚合物的孔徑一般都在10～50 μm，這與大多數(shù)細胞的尺寸（5～30 μm）相近[7-8]，事實上附著于這類微米纖維上的細胞未與材料充分接觸，仍然處于二維的微環(huán)境中[9]；藻酸鹽等有機材料復(fù)合物的機械性能和細胞黏附性差，作為細胞培養(yǎng)支架只能簡單地模擬天然組織，還不能更好地體現(xiàn)體內(nèi)細胞生長微環(huán)境。膠原Ⅰ是從動物體內(nèi)提取的一種水凝膠基質(zhì)，具有來源豐富、可塑性高、制作工藝相對簡單、臨床應(yīng)用方便[10-12]、免疫學背景清楚等特點。此外，膠原Ⅰ是含水凝膠，營養(yǎng)物可以自由進出凝膠網(wǎng)絡(luò)，同時還可以交聯(lián)生物活性因子調(diào)節(jié)細胞的生長和分化[13-14]，因此具有良好的親水性及細胞相容性。膠原Ⅰ適當?shù)臋C械性能和結(jié)構(gòu)特性促進了細胞與細胞、細胞與ECM的相互作用，作為三維培養(yǎng)支架材料時可為細胞生長提供一個適宜的微環(huán)境。

本研究以膠原Ⅰ為支架材料進行卵巢癌HO-8910PM細胞體外三維培養(yǎng)，通過觀察膠原Ⅰ基質(zhì)中細胞的形態(tài)、活力和增殖情況，發(fā)現(xiàn)膠原Ⅰ所形成的交叉網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)能夠充分支持卵巢癌細胞的生長，細胞在膠原Ⅰ基質(zhì)大部分存活，并集聚成團，呈空間立體生長，隨著培養(yǎng)時間的延長細胞團逐漸增大，該現(xiàn)象與二維培養(yǎng)細胞貼壁生長現(xiàn)象明顯不同，提示細胞生長微環(huán)境直接影響了細胞的形態(tài)。通過ELISA檢測二維和三維培養(yǎng)條件下腫瘤血管生成相關(guān)因子的分泌，結(jié)果顯示，三維培養(yǎng)下卵巢癌細胞VEGF-A、EGF和IGF-1的分泌量均比二維培養(yǎng)細胞分泌量高，其中VEGF-A和IGF-1的分泌量與二維細胞相比較均顯著增高，推測可能由于三維培養(yǎng)體系中，卵巢癌細胞聚集成團生長，隨著培養(yǎng)時間的延長細胞團逐漸增大，中心區(qū)域的細胞可能存在缺氧現(xiàn)象，從而促進了血管生成相關(guān)因子的分泌。由此可見，細胞外微環(huán)境極大地影響了細胞的形態(tài)及功能。卵巢癌細胞膠原Ⅰ三維培養(yǎng)體系的成功建立，將為從細胞外微環(huán)境治療卵巢癌提供研究的理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。

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本刊編輯部

The biological behaviors charater of ovarian carcinoma cells of a collagen three-dimensional cultivation system

Cai Guohui，Han Yunzhu，Tang Bin，Song Hong
（Department of Microbiology，Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563099，China）

ObjectiveTo establish the three-dimensional（3D）cultivation model of ovarian cancer HO-8910PM cell line using collagenⅠas scaffolds and observe the cellular morphologies，vitalities and functions to provide references for the study of ovarian cancer in vitro.MethodsTEM was used to be assess to representation of characteristics of collagenⅠformation.Relied oncollagenⅠasraw materials，itwasestablished three-dimensionalsystem model.The growthform and proliferation of ovarian carcinomacells were observed by inverted microscope.The viabilities of the ovarian carcinoma cells in the collagenⅠmatrix were examined by calcein-AM staining；The expression of VEGF-A，EGF and IGF-1 in collagenⅠmatrix were inspected by Elisa assay.ResultsCollagenⅠdisplayed a cross-linked network structure under transmission electron microscopeⅠ.The ovarian carcinoma cells in the collagenⅠmatrix were irregular regiment massive structure and showed a good vitality in the collagenⅠ.It had a good biocompatibility between the cells and matrix.Compared to two-dimensional cultured cells，the secretion quantity of VEGF-A，EGF and IGF1 in the three-dimensional cultivation system was higher.The difference had statistical significance（P＜0.05）.ConclusionCollagenⅠcan support ovarian cancer three-dimensional culture adequately with good structure and functions，which is suitable for three-dimensional cultivation of ovarian carcinoma cells in vitro，maintaining the form and functions of ovarian cancer cells.

Ovarian neoplasms；Culture techniques；Collagen typeⅠ；Vascular endothelial growth factors；Epidermal growth factor

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.05.002

:A

:1009-5519（2015）05-0642-03

2014-12-01）

國家自然科學基金資助項目（81160290）。

蔡國徽（1992-），女，云南昭通人，在讀碩士研究生，主要從事腫瘤細胞三維培養(yǎng)方面的研究；E-mail：874660990@qq.com。

宋鴻（E-mail：song-77@qq.com）。