孫新新，鄭家珍，王艷青，蔡世玉，陳雷剛(河北大學(xué)生命科學(xué)院，河北保定071200)

多聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHA)是一類廣泛存在于微生物細(xì)胞內(nèi)的高分子生物聚酯，一般主要作為碳源和能量的貯藏物質(zhì)［1］。目前，已發(fā)現(xiàn)PHAs至少有150種不同的單體結(jié)構(gòu)。PHA的單體結(jié)構(gòu)也多種多樣，其中3-羥基脂肪酸單體包括3-羥基丙酸到3-羥基十六酸的所有成員，還有4-、5-、6-羥基脂肪酸以及含有不飽和鍵、帶有甲基側(cè)鏈或其他功能基團(tuán)的3-羥基脂肪酸作為PHA單體的情況［2］。PHAs生產(chǎn)的關(guān)鍵仍然是獲得高產(chǎn)、高轉(zhuǎn)化率的微生物菌株［3］，所以從環(huán)境中篩選出高產(chǎn)野生菌株是研究工作的熱點(diǎn)。目前研究最廣泛的是真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes eutropbus)。

聚3-羥基丁酸酯(Polyhydroxybutyrate，PHB)是結(jié)構(gòu)最簡單的PHA成員。1925年Lemoigne［4］首先發(fā)現(xiàn)了聚β-羥基丁酸(PHB)。它具有機(jī)械性能非常類似于傳統(tǒng)的塑料如聚丙烯或聚乙烯，可擠出，模制，紡成纖維，制成薄膜，并與其他合成的聚合物組成雜聚物［5］。它既可以替代石化塑料制作生產(chǎn)與生活用品，又可以作為醫(yī)用材料(如心臟瓣膜、人造血管、縫合線、藥物緩釋與軟組織修復(fù))［6］，還是醫(yī)學(xué)組織工程中克隆器官的優(yōu)良支架材料。筆者以苜蓿含羞草根瘤菌以及根際土壤菌為研究材料，通過革蘭氏染色、蘇丹黑染色，篩選得到一株菌為227。

1 材料與方法

1.1 菌株

1.1.1 菌種來源。海南、廣東、廣西、福建自含羞草分離的根瘤菌株，云南祿豐南苜蓿根瘤菌及獲得的根瘤內(nèi)生菌。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑。YMA培養(yǎng)基組成為:KH2PO40.25 g，K2HPO40.25 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，甘露醇10 g，酵母粉0.8 g，瓊脂15 ～18 g，pH 6.5 ～7.0。種子培養(yǎng)基組成為:牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，pH 7.0 ～7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:葡萄糖30 g，(NH4)2SO43 g，KH2PO4·12H2O 0.61 g，CaCl20.1 g，K2HPO40.3 g，酵母粉 1 g，HBO35 g/L，Na2MoO45 g/L 4 ml，pH 7.0［7］。PHB 標(biāo)準(zhǔn)品由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。稱取3 g蘇丹黑B顆粒(西德serva進(jìn)口分裝)，溶到100 ml濃度70%的乙醇中［8］，得蘇丹黑B染液。

1.2 方法

1.2.1 活化菌株。將保存的甘油管菌株活化到Y(jié)MA固體培養(yǎng)基，平板倒置28℃培養(yǎng)1～2 d。

1.2.2 初篩。將菌株活化后重新編號1～2 000，轉(zhuǎn)接到Y(jié)MA固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于28℃培養(yǎng)24～48 h后進(jìn)行革蘭氏染色。

1.2.3 復(fù)篩。采用蘇丹黑染色法將少許細(xì)菌熱固定于載玻片上后，用3 g/L蘇丹黑乙醇溶液染色10～15 min，二甲苯浸泡脫色，再用5 g/L番紅水溶液復(fù)染，置油鏡下觀察，PHB顆粒呈藍(lán)黑色，菌體呈紅色［8］。

1.2.4 PHA的提取。從試管中取一環(huán)菌接種到10 ml發(fā)酵管中，培養(yǎng)20 h。發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為76 ml，取培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液4 ml，接種量為5%，培養(yǎng)40 h。將發(fā)酵液以8 000 r/min離心10 min，蒸餾水洗滌、離心，然后冰凍備用。將離心獲得的濕菌體懸浮于45 ml蒸餾水中，加入濃度10%NaClO溶液5 ml、濃度10%SDS 5 ml，使其總體積為50 ml，在35 ℃的恒溫水浴中攪拌處理10 min。將處理后的菌液8 000 r/min離心10 min，所獲得的沉淀用蒸餾水和丙酮各洗滌1次，烘干，按照10 ml氯仿/0.2 g干菌體的比例加入氯仿，抽提，過濾，濾液蒸發(fā)，除去氯仿，以析出PHB。將析出的PHB再分別用丙酮和乙醇洗滌1次，在60～70℃的條件下烘干，得到白色粉末或薄膜狀PHB［9］。

1.2.5 篩選菌株的確定。

1.2.5.1 GUTC 法提 DNA。用濃度0.9%生理鹽水收集 TY斜面上的菌，每個(gè)斜面取1 ml生理鹽水沖洗菌體，加入到EP管，12 000 r/min離心2 min，離心洗滌3次，棄上清液，加入600 μl GUTC 緩沖液振蕩、搖勻，室溫放置 15 min，12 000 r/min 2 min，棄上清液，加入60 μl硅藻土懸液振蕩，室溫放置 15 min，12 000 r/min 2 min，棄上清液，加入 500 μl GUTC緩沖液振蕩、搖勻，室溫放置15 min，12 000 r/min 2 min，棄上清液，加入600 μl洗滌緩沖液離心洗滌2次，12 000 r/min 2 min，棄上清，加入600 μl濃度75%乙醇離心洗滌1次，12 000 r/min 2 min，棄上清，在超凈工作臺干燥沉淀物(硅藻土變白)，加入50 μl TEbuffer 55 ～65 ℃保溫5 ～7 min［10］，離心收集上清液至小EP管中。

1.2.5.2 PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃ 退火 30s，72 ℃ 延伸 90 s，72 ℃8 min，30 個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩 初篩的結(jié)果見圖1。根據(jù)菌體中心未染色的面積的大小，篩得200株。

2.2 復(fù)篩 利用蘇丹黑B染色初篩得到的菌株的結(jié)果見圖2。菌體外圍泛紅、內(nèi)部可見明顯的藍(lán)黑色顆粒的菌株可能是產(chǎn)生PHAs的細(xì)菌，最后篩得一株P(guān)H產(chǎn)生菌。

2.3 菌株227的形態(tài)特征 菌株227桿狀，兩端鈍圓，無芽孢，革蘭氏陰性菌;細(xì)胞大小(0.5 ～0.9)μm ×(1.2 ～3.0)μm;PHB顆粒胞內(nèi)舍嗜蘇丹黑B顆粒，占細(xì)胞大部分空間;菌落濕潤光滑有光澤、邊緣整齊。

2.4 PHB的提取 提取后得到PHB干品，見圖3。

2.5 227菌株16s rDNA測序結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育的分析 測序結(jié)果如下:

將該序列已登陸到GeneBank，注冊號為HM582870.1。將227菌株的16S rDNA序列在NCBI進(jìn)行BLAST，所獲得的同源序列為根瘤菌的16S rDNA序列，其中相似性最高的為伯克霍爾德屬的菌株。227菌株與Burkholderia caribensis，Burkholderia hospita的同源性最高，均為98%，因此確定227菌株屬于伯克霍爾德屬。

3 結(jié)論與討論

(1)研究中，采用革蘭氏染色，進(jìn)行PHB產(chǎn)生菌的篩選。由于根瘤菌為革蘭氏陰性菌，菌體內(nèi)的酯類會呈現(xiàn)出中心亮點(diǎn)，類似芽孢狀，呈不規(guī)則狀。經(jīng)蘇丹黑B染色，結(jié)合顯微鏡檢，選出PHB顆粒較大、生長較旺盛的菌株。該方法大大減少了篩選過程中的工作量，而且取得較好的效果。通過革蘭氏染色、蘇丹黑染色篩選得到的菌體更加準(zhǔn)確。

(2)經(jīng)初篩、復(fù)篩獲一高產(chǎn)PHB菌株227，胞內(nèi)積累大量的PHB顆粒，而且發(fā)酵周期短，為今后發(fā)酵條件的進(jìn)一步研究提供保證。

(3)在經(jīng)過生物學(xué)特征研究后，發(fā)現(xiàn)菌株227為伯克霍爾德屬(Burkholderia)。它是根瘤菌中初次發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)PHB的菌株。因此，該研究為PHB的產(chǎn)業(yè)化提供了菌株資源，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

［1］于平，勵(lì)建榮.真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌發(fā)酵生產(chǎn)PHB的培養(yǎng)條件優(yōu)化［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2007，7(1):59-63.

［2］STEINBüCHEL A，VALENTIN H E.Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoic acids［J］.FEMS Microbiol Lett，1995，128:219-228.

［3］陳國強(qiáng).生物可降解材料產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與趨勢分析［J］.新材料產(chǎn)業(yè)，2007(12):42-46.

［4］LEMOIGNE M，ANN.Etudes sur l＇autolyse microbie acidification par formation d＇acide β-oxybutyrique［J］.Ann Inst Pasteur，1925，39:144-173.

［5］KHANNA S，SRIVASTAVA A K.Recent advances in microbial polyhydroxyalkanoates［J］.Process Biochemistry，2005(40):607-619.

［6］張巖峰，田立，宋水山.聚-4-羥基丁酸的微生物合成及醫(yī)學(xué)應(yīng)用［J］.工程塑料應(yīng)用，2011，39(1):48-52.

［7］張嬋，董岳峰，王海賓，等.費(fèi)氏中華根瘤菌合成羥基丁酸和羥基己酸共聚物的研究［J］.微生物學(xué)雜志，2007，34(6):1077-1081.

［8］李市場，劉紅霞，朱朝陽.低能離子注入油脂高產(chǎn)菌株黏紅酵母(Rhodotorula glutinis)的選育［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2011，26(8):33-34.

［9］許旭萍，陳接鋒，謝華玲.次氯酸鈉-氯仿提取球衣菌PHB的研究［J］.福建師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2004，20(1):74-77.

［10］劉曉鳳.一株嗜鹽產(chǎn)甲烷菌的分離、生物學(xué)特性、系統(tǒng)發(fā)育分析及產(chǎn)甲烷活性污泥利用CO的初步研究［D］.成都:四川大學(xué)，2006:26-28.