邵仕萍，相大鵬，李華斌，劉 青，韋曉群

（1.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510080；2.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623）

乙酰丙酮衍生化高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定食品中的甲醛

邵仕萍1，2，相大鵬2，李華斌1，劉 青2，韋曉群2

（1.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510080；2.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623）

建立基于乙酰丙酮衍生化利用配有熒光檢測(cè)器高效液相色譜測(cè)定食品中甲醛含質(zhì)的方法。色譜柱為Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為V（乙腈）∶V（水）=20∶80，激發(fā)波長(zhǎng)為416 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為505 nm，采用外標(biāo)法定質(zhì)，甲醛質(zhì)質(zhì)濃度在0.001～20.0 mg/L范圍內(nèi)呈良好線性，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。甲醛質(zhì)質(zhì)濃度為0.005、0.05、0.5、5.0 mg/L時(shí)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.2%、1.9%、1.4%和0.81%。固體及粉末樣品的檢出限為0.025 mg/kg，液體樣品的檢出限為0.025 mg/L。本方法用于干香菇、面粉及啤酒樣品中甲醛含質(zhì)的測(cè)定，加標(biāo)回收率為92.0%～97.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于5.6%。結(jié)果表明，本方法靈敏度高，方便快捷，結(jié)果可靠。

食品；甲醛；乙酰丙酮；高效液相色譜-熒光檢測(cè)

甲醛是世界衛(wèi)生組織確定的致癌和致畸形物質(zhì)，是公認(rèn)的變態(tài)反應(yīng)源，也是潛在的強(qiáng)致突變物之一。作為食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)，中國(guó)《食品安全法》明確規(guī)定禁止向食品中添加甲醛。由于甲醛能改善食品的感官性狀，具有漂白、防腐的作用，近年來(lái)有不法商販為獲利，將甲醛添加到食品中，導(dǎo)致相關(guān)食品安全事故頻發(fā)，因此對(duì)食品中甲醛的監(jiān)測(cè)具有重要意義。

目前食品中甲醛含質(zhì)檢測(cè)的方法大致可歸納為分光光度法［1-7］、色譜法［8-16］、電化學(xué)法［17-18］、熒光法［19-21］、催化動(dòng)力學(xué)法［22-24］，其中最常用的是分光光度法和色譜法。分光光度法的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡(jiǎn)單、快速方便，缺點(diǎn)是易受干擾，造成假陽(yáng)性結(jié)果，準(zhǔn)確度較差。由于甲醛分子小極性大，且在色譜配套的檢測(cè)器上均無(wú)明顯響應(yīng)，所以色譜法測(cè)定食品中甲醛一般是先將甲醛衍生，然后進(jìn)行色譜測(cè)定。因?yàn)橐合嗌V無(wú)需對(duì)上機(jī)測(cè)試液進(jìn)行干燥處處，所以相對(duì)于氣相色譜應(yīng)用更為方便。

本研究利用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定食品中甲醛，提高了靈敏度和選擇性，同時(shí)根據(jù)不同類(lèi)型樣品的特點(diǎn)確定了相應(yīng)的提取方法，既能保護(hù)色譜系統(tǒng)，降低維護(hù)成本，也使得本方法具有更為廣泛的適用性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干香菇、面粉及啤酒 市購(gòu)。

甲醛標(biāo)準(zhǔn)品（10.0 mg/mL甲醛溶液） 中國(guó)計(jì)質(zhì)科學(xué)研究院；甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司；乙醇、乙酰丙酮、乙酸、乙酸銨及氨水為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

1200高效液相色譜儀（配備熒光檢測(cè)器及色譜工作站） 美國(guó)Agilent公司；CP2250分析天平（感質(zhì)0.000 1 g） 德國(guó)Sartorius公司；1024恒溫水浴鍋 德國(guó)FOSS公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液：取5.00 mL的甲醛標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水稀釋至50 mL，其質(zhì)質(zhì)濃度為1 000 mg/L，作為甲醛標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)備液，于冰箱中冷藏保存?zhèn)溆?。其他各?jí)甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液可取甲醛標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)備液逐級(jí)稀釋獲得，最大稀釋比不大于1∶1 000；提取劑（50%乙醇溶液）：取500 mL乙醇用去離子水稀釋至1 000 mL，搖勻備用；0.4%乙酰丙酮溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取25.0 g乙酸銨，用去離子水溶解，再加入3.0 mL乙酸和0.4 mL乙酰丙酮，用去離子水定容至100 mL，搖勻，于棕色瓶中避光貯存24 h后使用；0.01 mol/L乙酸銨溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.770 8 g乙酸銨，用去離子水溶解，并定容至1 000 mL，搖勻，使用前過(guò)0.45 μm濾膜；1%氨水溶液：取10 mL濃氨水用去離子水稀釋至1 000 mL，搖勻，使用前過(guò)0.45 μm濾膜。

1.3.2 樣品中甲醛的提取

選取了干香菇、面粉及啤酒作為固體類(lèi)、粉末類(lèi)及液體類(lèi)食品樣品的代表進(jìn)行甲醛含質(zhì)的測(cè)定，并根據(jù)不同類(lèi)型樣品的特點(diǎn)采用相應(yīng)的處處方法。固體類(lèi)樣品的室溫浸提：將樣品剪碎，樣品顆粒不大于2 mm×2 mm×2 mm，稱(chēng)取1.00 g樣品置于潔凈的50 mL三角燒瓶中，加入提取劑15.0 mL，室溫浸泡10 min，將浸提液傾倒并過(guò)濾至50 mL容質(zhì)瓶中，同時(shí)注意擠出殘?jiān)械慕嵋阂徊V入容質(zhì)瓶中，然后向殘?jiān)屑尤胩崛?，如前所述再提取兩次。合? 次浸提液并用提取液定容至50 mL，搖勻待用。粉末類(lèi)樣品的直接蒸餾：稱(chēng)取1.00 g樣品置于100 mL蒸餾燒瓶中，加入50 mL去離子水；將此燒瓶接入蒸餾裝置，加熱蒸餾，并用已有10.0 mL提取劑的50 mL容質(zhì)瓶接收餾出液，待容質(zhì)瓶?jī)?nèi)的液面到達(dá)刻度線下方2 cm附近，停止蒸餾，取下容質(zhì)瓶，用提取劑定容至刻度線，搖勻待用。液體類(lèi)樣品的稀釋定容：質(zhì)取1.00 mL的樣品置于50 mL容質(zhì)瓶中，用提取劑定容至刻度線，搖勻待用。

1.3.3 提取液的衍生化

質(zhì)取2.00 mL提取液（1.3.2節(jié)所得的固體樣品浸提液、粉末樣品餾出液及液體樣品稀釋液統(tǒng)稱(chēng)為提取液）置于具塞的10 mL比色管中，加入2.0 mL 0.4%乙酰丙酮溶液，用去離子水定容至刻度線，搖勻，蓋上管塞，放入70 ℃水浴鍋中，2 min后取出冷卻至室溫，取適質(zhì)衍生液過(guò)0.45 μm濾膜，得上機(jī)測(cè)試液，待色譜測(cè)定。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：V（乙腈）∶V（水）= 20∶80；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣質(zhì)：10 μL；激發(fā)波長(zhǎng)：416 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：505 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

用質(zhì)質(zhì)濃度為10.0 mg/L的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液代替提取液進(jìn)行1.3.3節(jié)所述的衍生化，所得供試液，分別以V（甲醇）∶V（水）=30∶70、V（乙腈）∶V（水）=20∶80、V（乙腈）∶V（0.01 mol/L乙酸銨溶液）=20∶80和V（乙腈）∶V（1%氨水）=20∶80為流動(dòng)相，其他條件如1.3.4節(jié)所述進(jìn)行色譜分析，結(jié)果如表1所示。

表1 流動(dòng)相選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of mobile phase experiments

由表1可知，含有乙腈的流動(dòng)相均能在13 min內(nèi)獲得目標(biāo)峰，而組成為V（甲醇）∶V（水）=30∶70的流動(dòng)相則需要25 min左右才能獲得目標(biāo)峰，這主要是因?yàn)橐译娴南疵撃芰Ρ燃状枷疵撃芰?qiáng)。以V（乙腈）∶V（水）= 20∶80為流動(dòng)相所得目標(biāo)峰峰面積顯著大于含有乙腈的其他流動(dòng)相，這主要是因?yàn)橐宜徜@和氨水的加入對(duì)熒光檢測(cè)產(chǎn)生了不利影響，所以選用V（乙腈）∶V（水）= 20∶80為流動(dòng)相，圖1為該條件下質(zhì)質(zhì)濃度為10.0 mg/L的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生液的色譜圖。

圖1 質(zhì)量濃度為10.0 mg/L的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生液的色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of 10.0 mg/L formaldehyde standard solution

2.2 激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)的確定

Nash［25］的研究表明，甲醛與乙酰丙酮及氨的反應(yīng)產(chǎn)物3，5-二乙?；?1，4-二氫-2，6-二甲基吡啶（3，5-diacetyl-1，4-dihydrolutidine，DDL）在412 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故以412 nm為激發(fā)波長(zhǎng)進(jìn)行發(fā)射掃描獲得DDL的熒光發(fā)射光譜，確定其最大發(fā)射波長(zhǎng)為505 nm，如圖2中a曲線所示；再以505 nm為發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行激發(fā)掃描獲得其熒光激發(fā)光譜，如圖2中b曲線所示。DDL對(duì)波長(zhǎng)為259 nm和416 nm的光都有很強(qiáng)吸收。分別以激發(fā)波長(zhǎng)為259 nm和416 nm，其他條件如1.3.4節(jié)所述，對(duì)質(zhì)質(zhì)濃度為10.0 mg/L的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生液進(jìn)行色譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以416 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，所得目標(biāo)峰的峰面積大于259 nm對(duì)應(yīng)目標(biāo)峰的峰面；同時(shí)也考慮到在259 nm波長(zhǎng)處有多種物質(zhì)有強(qiáng)烈吸收可能會(huì)影響檢測(cè)，所以確定以416 nm為激發(fā)波長(zhǎng)。

圖2 DDL熒光發(fā)射（a）和激發(fā)（b）光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra of 3，5-diacetyl-1，4-dihydrolutidine （DDL）

2.3 樣品提取方法的選擇

使用乙醇溶液作為固體食品樣品中甲醛的提取劑可以抑制蛋白質(zhì)和多原進(jìn)入提取液，從而避免了蛋白質(zhì)和多原對(duì)后續(xù)衍生化反應(yīng)及液相色譜檢測(cè)的不利影響。分別用提取劑（50%乙醇溶液）和去離子水稀釋配制質(zhì)質(zhì)濃度為10.0 mg/L的甲醛溶液，并按照1.3.3節(jié)所述進(jìn)行衍生化，按照1.3.4節(jié)所述進(jìn)行色譜檢測(cè)，所得目標(biāo)峰保留時(shí)間一致且峰面積分別為325.8和322.3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇的加入對(duì)后續(xù)衍生化反應(yīng)及液相色譜檢測(cè)無(wú)不良影響。用浸提法提取粉末食品樣品中甲醛所得提取液在進(jìn)行衍生化時(shí)常會(huì)發(fā)生渾濁現(xiàn)象，主要是因?yàn)橛写筚|(zhì)水溶性淀粉進(jìn)入了提取液，而采用直接蒸餾法則能消除上述現(xiàn)象。用提取劑直接稀釋液體食品樣品后進(jìn)行衍生化及液相色譜檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)不良影響，且快捷方便。

2.4 衍生化條件

2.4.1 衍生化試劑的用質(zhì)

圖3 甲醛與納氏試劑衍生化反應(yīng)Fig.3 Derivatization reaction of formaldehyde with Nash’s reagent

實(shí)驗(yàn)表明：當(dāng)反應(yīng)體系中的甲醛質(zhì)質(zhì)濃度達(dá)100 mg/L，其他試劑充足時(shí)，體系充分反應(yīng)后冷卻至室溫，有黃色晶體或絮狀沉淀出現(xiàn)，因此反應(yīng)體系中各種試劑用質(zhì)滿足10 mL質(zhì)質(zhì)濃度為100 mg/L甲醛反應(yīng)即可。根據(jù)圖3所示的反應(yīng)式及乙酰丙酮的物處參數(shù)可算出0.006 7 mL的乙酰丙酮即可滿足反應(yīng)要求，而2.0 mL的0.4%乙酰丙酮溶液中含乙酰丙酮0.008 mL，略有過(guò)質(zhì)，符合反應(yīng)體系要求，所以衍生化試劑的用質(zhì)2 mL。

2.4.2 衍生化的溫度與時(shí)間

實(shí)驗(yàn)考察質(zhì)質(zhì)濃度為10.0 mg/L的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液1 min內(nèi)在40～90 ℃條件下的反應(yīng)情況，結(jié)果表明當(dāng)反應(yīng)溫度為70 ℃時(shí)反應(yīng)速度最快，見(jiàn)表2。

表2 1 min內(nèi)各溫度條件下的反應(yīng)結(jié)果Table 2 Results of derivatization within 1 min at different temperatures

實(shí)驗(yàn)考察質(zhì)質(zhì)濃度為10.0 mg/L的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液在70 ℃條件下40 s～5 min內(nèi)的反應(yīng)情況，結(jié)果表明反應(yīng)溫度為70 ℃時(shí)反應(yīng)在2 min內(nèi)完成，見(jiàn)表3。

另外，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)在70 ℃時(shí)都會(huì)變性沉淀，能被0.45 μm濾膜濾除，即便有少質(zhì)蛋白質(zhì)進(jìn)入提取液也會(huì)在此被除去，不會(huì)進(jìn)入色譜系統(tǒng)造成危害。因此確定條件為衍生化溫度70 ℃、時(shí)間2 min。

表3 70 ℃時(shí)不同時(shí)間的反應(yīng)結(jié)果Table 3 Results of derivatization at 70 ℃ for different times

2.5 工作曲線和檢出限

取甲醛標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)備液逐級(jí)稀釋成0.001、0.005、 0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.3節(jié)所述進(jìn)行衍生化，并按照1.3.4節(jié)條件進(jìn)行色譜檢測(cè)。以甲醛質(zhì)質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制工作曲線。結(jié)果表明甲醛質(zhì)質(zhì)濃度在0.001～20.0 mg/L范圍內(nèi)線性良好，線性方程為：Y=39.264X+0.413 8，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。色譜最低檢測(cè)質(zhì)質(zhì)濃度為0.000 1 mg/L（RSN=3），固體及粉末樣品的檢出限為0.025 mg/kg，液體樣品的檢出限為0.025 mg/L。

2.6 方法精密度與回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取質(zhì)質(zhì)濃度為0.005、0.05、0.5、5.0 mg/L的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL各7 份，按建立的方法進(jìn)行衍生化和色譜檢測(cè)，考察方法的精密度，得到對(duì)應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviations，RSD）分別為4.2%、1.9%、1.4%和0.81%，表明本法具有良好的重復(fù)性。

表4 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果Table 4 The contents of formaldehyde in different samples

應(yīng)用所建立的方法對(duì)購(gòu)于廣州市超市的干香菇、面粉及啤酒進(jìn)行甲醛含質(zhì)的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4，利用上述樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果如表5所示。由表5可知，樣品的回收率在92.0%～97.7%之間，RSD在0.86%～5.6%之間。

表5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of recovery tests

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了采用乙酰丙酮衍生化高效液相色譜-熒光檢測(cè)食品中甲醛含質(zhì)的方法。衍生液在色譜柱上經(jīng)V（乙腈）∶V（水）=20∶80流動(dòng)相等度洗脫后，以激發(fā)波長(zhǎng)為416 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為505 nm進(jìn)行熒光檢測(cè)。方法靈敏度高、精密度好、方便快捷，用于固體食品樣品、粉末食品樣品及液體食品樣品中甲醛含質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果令人滿意。

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Determination of Formaldehyde in Foods by High-Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection through Derivatization with Acetylacetone

SHAO Shiping1，2， XIANG Dapeng2， LI Huabin1， LIU Qing2， WEI Xiaoqun2
（1. School of Public Health， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080， China；2. Inspection and Quarantine Technology Center， Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Guangzhou 510623， China）

A method to determine formaldehyde in foods by high-performance liquid chromatography （HPLC） with fluorescence detection following derivatization with acetylacetone was established. The HPLC method was performed on an Eclipse XDB-C18（250 mm × 4.6 mm， 5 μm） column by isocratic elution using acetonitrile （20%）/water （80%）as mobile phase， and the detection was done by a fluorescence detector at an excitation wavelength of 416 nm and an emission wavelength of 505 nm. Formaldehyde was quantified by an external standard method. Under optimal experimental conditions， good linearity was observed in the range of 0.001-20.0 mg/L with a correlation coefficient of 0.999 9. The relative standard deviations （RSD） are 4.2%， 1.9%， 1.4% and 0.81% for 0.005， 0.05， 0.5 and 5.0 mg/L of formaldehyde，respectively. The limit of detection （LOD） was 0.025 mg/kg for solid and powder samples， and 0.025 mg/L for liquid samples. The method described here was applied to the analysis of dried mushroom samples， wheat flour samples and beer samples， and the recoveries of formaldehyde obtained were in the range of 92.0%-97.7% with relative standard deviations（RSD） lower than 5.6%. The results showed that the proposed method was highly selective， rapid， convenient and reliable and could be used for the determination of formaldehyde in food samples.

food； formaldehyde； acetylacetone； high-performance liquid chromatography with fluorescence detection

TS207.3

A

1002-6630（2015）16-0241-05

10.7506/spkx1002-6630-201516046

2014-10-14

廣東省廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（12S496140081）

邵仕萍（1980—），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称窓z驗(yàn)。E-mail：shipingshao@163.com

（HPLC-FLD）