惠伯棣，宮 平

（北京聯合大學應用文理學院食品科學系，北京 100191）

新疆和內蒙古地區(qū)油葵舌狀花中全反式葉黃素含量的分析

惠伯棣，宮 平

（北京聯合大學應用文理學院食品科學系，北京 100191）

檢測我國新疆（樣品Ⅰ）和內蒙古（樣品Ⅱ）地區(qū)油葵舌狀花樣品中的全反式葉黃素含量，以評價其作為葉黃素新資源的可能性，并為提高當地油葵產業(yè)的經濟附加值提供相對含量測定的依據。結果表明：樣品Ⅰ和Ⅱ全反式葉黃素含量（以樣品干質量計算）分別為1.5‰和0.8‰。該油葵舌狀花中的葉黃素可考慮作為葉黃素潛在的新資源。

葵花；舌狀花；類胡蘿卜素；葉黃素；C18-高效液相色譜；C30-高效液相色譜

葵花（Helianthus annuus L.）又稱向日葵、西番菊、太陽花等，屬菊科，為一年生草本植物，起源于北美，現有52 個品種[1]。該植物在我國東北、華北和西北的新疆、甘肅、寧夏、內蒙、山西、黑龍江、吉林等地被作為農作物大面積種植。尤其在我國的新疆和內蒙古地區(qū)，葵花的種植在當地的農業(yè)和產業(yè)中已經占有重要的比重。在內蒙古中東部地區(qū)，常年種植面積便有幾十萬畝。在新疆地區(qū)，常年種植面積已有近200萬 畝。按加工用途劃分，栽培葵花可作為油料作物（又稱油葵）、食用作物（又稱食葵）和觀賞植物（又稱花葵）[1-2]。油葵已經成為我國第三大油料作物。除舌狀花（又稱花舌）外，葵花（包括油葵和食葵）植株的全身均已被加工利用。同時，葵花全草皆可入藥，花舌可祛風明目[1]。

葵花的花舌即是其頭狀花序外周的舌狀花，以黃色、橙色多見。其中主要色素為脂溶性的類胡蘿卜素類物質，主要為葉黃素類化合物。其中的葉黃素類化合物與脂肪酸酯化，以酯的形式存在[3]。葉黃素類化合物含有雙羥基，以葉黃素、玉米黃素最為常見。二者互為幾何異構體，其結構見圖1[4-6]。目前已知葉黃素和玉米黃素均為黃斑色素。大量補充二者均可降低黃班衰退癥的風險，并對視網膜有保護作用。二者都具有優(yōu)秀的單線態(tài)氧淬滅能力。因此，這2 種化合物對人體健康均有著積極影響[7-10]。

圖1 葉黃素（A）和玉米黃素（B）結構式Fig.1 Molecular structures of lutein （A） and zeaxanthin （B）

目前，生產天然葉黃素的主要原料是萬壽菊（Tagetes erecta）的花。天然玉米黃素的理想資源是枸杞果實。作為羥基類胡蘿卜素的天然資源，萬壽菊與枸杞二者均為栽培作物，其生產均占用農業(yè)資源。本研究的目的是對油葵舌狀花中的全反式黃色素進行定量分析。預期結果將對評價油葵舌狀花中的葉黃素資源有一定的參考價值。這一努力對開發(fā)葉黃素類物質新資源和提高葵花產業(yè)的經濟附加值具有現實的意義。

1 材料與方法

1.1 樣品

舌狀花樣品Ⅰ采集自新疆伊犁-阿勒泰地區(qū)，樣品Ⅱ采集自內蒙包頭市固陽地區(qū)。每個樣品采收地面積6 670 m2以上，品種統(tǒng)一，采收時間為種子收獲期前15 d。干燥方法：70 ℃條件下常壓干燥至質量恒定。樣品最終含水量小于15%。樣品采集方法設計符合統(tǒng)計學原理，以保障結果具有代表性。

1.2 試劑

葉黃素參比樣品（C/N：0133，純度96%，包裝規(guī)格為5 mg/瓶）、（3R, 3’R）玉米黃素參比樣品（C/ N：0119），純度97%，包裝規(guī)格為5 mg/瓶） 瑞士CaroNature公司；正己烷、95%乙醇、KOH和NaCl（均為分析純） 北京化工廠；乙腈、乙酸乙酯、甲醇和甲基叔丁基醚（均為色譜純） 美國迪馬公司。

1.3 儀器與設備

Multispec-1501紫外-可見光分光光度計 日本Shimadzu公司；C18色譜柱為DiamondsTMDikma Technologies（4.6 mm×250 mm，5 μm）；C30色譜柱為YMCTMCarotenoid（4.6 mm×250 mm，5 μm）；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、PU-2080 Plus流動相輸送系統(tǒng)、UV-2075紫外檢測器 日本Jasco公司。

1.4 方法

1.4.1 總類胡蘿卜素萃取

將干燥的油葵舌狀花用咖啡磨粉碎，過40 目篩。準確（精確至0.000 1 g）稱取0.5 g粉末于研缽中，用10 mL正己烷研磨萃取。適時用滴管將上清液取出、收集。重復萃取6 次，至上清液無色。合并萃取液，定容于50 mL棕色容量瓶中。定容液直接用于C18-HPLC檢測。定容液稀釋10 倍后用于紫外-可見光分光光度計檢測。每個樣品做平行樣6 份，結果取平均值。

1.4.2 皂化制備游離態(tài)葉黃素

將萃取液按1∶1體積比加入10%的KOH-乙醇溶液進行皂化。皂化條件：避光、充氮、室溫、慢速磁力攪拌。反應2 h后，按1∶1體積比加入5%的NaCl溶液，緩慢搖動后靜置，待出現分層后收集上相，下相用25 mL正己烷萃取2～3 次，直到無色。將上相與萃取液合并，定容于50 mL棕色容量瓶中。定容體積超出刻度時用氮氣吹至刻度。定容液用于C18-HPLC、C30-HPLC檢測，稀釋10 倍后用于UV-VIS檢測。

1.4.3 葉黃素類化合物的檢測

取皂化前樣品用紫外-可見光分光光度計在450 nm波長處以正己烷為參比測定樣品的吸光度，根據Beer-Lambert定律，按公式（1）計算樣品液中總類胡蘿卜素質量：

式中：A為450nm波長處的吸光度；V為樣品體積/mL；MTCA為總類胡蘿卜素質量/mg。

根據樣品質量（0.5 g）計算樣品中總類胡蘿卜素含量，以干質量計算。取皂化后樣品用紫外-可見光分光光度計在450 nm波長處以正己烷為參比比色，根據式（1）計算樣品中游離態(tài)總類胡蘿卜素質量。根據樣品質量（0.5 g）計算樣品中游離態(tài)總類胡蘿卜素含量，以干質量計算。

根據皂化前后結果按式（2）計算皂化損失率：

式中：L為皂化損失率/%；A前為皂化前吸光度；A后為皂化后吸光度。

C18-HPLC檢測皂化前后樣品中的類胡蘿卜素組成。色譜條件：色譜柱為DiamonsilTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為乙腈-水（9∶1，V/V）；流動相B為乙酸乙酯；梯度洗脫：20 min內，流動相B由0%上升到100%，之后5 min流動相B保持100%；檢測波長450 nm，流速：1 mL/min，進樣量20 μL[11-12]。根據色譜圖上組分的保留時間與參比樣品的比較定性葉黃素-玉米黃素組分，并根據色譜圖上各組分峰面積計算葉黃素-玉米黃素組分相對含量。按式（3）計算樣品中游離態(tài)葉黃素-玉米黃素組分質量：

式中：m1為樣品中游離態(tài)葉黃素-玉米黃素組分質量；m2為樣品中游離態(tài)總類胡蘿卜素質量（紫外-可見光分光光度計檢測）；m3為樣品中游離葉黃素-玉米黃素組分相對含量（C18-HPLC檢測）。

根據樣品質量（0.5 g）計算樣品中游離態(tài)葉黃素-玉米黃素組分含量，以千分單位計。

比較樣品皂化前后的C18-HPLC色譜圖。計算皂化后消失的類胡蘿卜素酯組分峰面積之和，按式（4）計算樣品中總類胡蘿卜素酯相對含量。

式中：M為總類胡蘿卜素酯組分相對含量；A1為類胡蘿卜素酯組分峰面積；A2為類胡蘿卜素組分峰面積。

C30-HPLC檢測皂化后葉黃素的幾何異構體組成。色譜柱為YMCTMCarotenoid（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為乙腈-甲醇（3∶1，V/V）；流動相B為甲基叔丁基醚；梯度洗脫：20 min內，流動相B由0%上升到55%，之后10 min流動相B保持55%；檢測波長450 nm，流速：1 mL/min，進樣量20 μL[4,13-17]。根據色譜圖上組分的保留時間與參比樣品的比較定性全反式葉黃素、玉米黃素及其幾何異構體組分，并根據色譜圖上全反式葉黃素、玉米黃素及其順式異構體組分峰面積，計算全反式葉黃素組分相對含量。按式（5）計算樣品中全反式葉黃素質量：

式中：m全為樣品中全反式葉黃素組分含量；m0為樣品中葉黃素-玉米黃素組分含量（C18-HPLC）；m相對為樣品中全反式葉黃素組分相對含量（C30-HPLC）；根據樣品質量（0.5 g）計算樣品中全反式葉黃素組分含量，以千分單位計。

2 結果與分析

2.1 舌狀花中總類胡蘿卜素含量

皂化前每個樣品在450 nm波長處測定吸光度，按式（1）計算其總類胡蘿卜素含量分別為（樣品Ⅰ）4.3‰和（樣品Ⅱ）2.2‰。

2.2 舌狀花中總游離態(tài)類胡蘿卜素含量

皂化后每個樣品在450 nm波長處測定吸光度按式（1）計算樣品總游離態(tài)類胡蘿卜素含量分別為（樣品Ⅰ）2.8‰和（樣品Ⅱ）1.5‰。

與皂化前樣品的吸光度比較，按式（2）計算，每個樣品的皂化損失率分別為35%和34%。

2.3 舌狀花中總類胡蘿卜素酯含量

圖2為樣品Ⅰ皂化前、后的C18-HPLC色譜圖。皂化前樣品C18-HPLC色譜圖中，保留時間為8.32 min的組分為葉黃素，保留時間為11.58、17.41、18.11、18.68 min的組分在皂化后消失。其中11.58 min的組分為葉黃素單酯可能性較大，17.41、18.11、18.68 min的組分為葉黃素雙酯可能性較大[3]。根據各組分峰面積，按式（4）計算其峰面積之和占總峰面積的比例，樣品Ⅰ為64%，樣品Ⅱ為61%。故二者的總類胡蘿卜素酯含量分別為（樣品Ⅰ）2.6‰和（樣品Ⅱ）1.3‰。

圖2 葵花舌狀花正己烷萃取物皂化前（A）和皂化后（B）的C1188-HHPPLLCC圖Fig.2 C18-HPLC profiles of hexane extract from the ray florets of sunflower before （A） and after （B） saponification

2.4 葉黃素-玉米黃素組分含量

圖3 全反式葉黃素參比樣品CC1188-HPPLLCC圖Fig.3 C18-HPLC profile of all E-lutein

圖3 為葉黃素參比樣品C18-HPLC色譜圖。皂化后樣品C18-HPLC色譜圖中保留時間為8.30 min的組分與葉黃素參比樣品8.25 min的組分保留時間基本一致。據此，定性該組分為葉黃素-玉米黃素組分。

根據圖2峰面積，計算葉黃素-玉米黃素組分的相對比例。樣品Ⅰ中葉黃素-玉米黃素組分占總峰面積的60%，樣品II中葉黃素-玉米黃素組分占總峰面積的62%。按式（3）計算，樣品Ⅰ中葉黃素-玉米黃素組分的含量為1.7‰，樣品Ⅱ中葉黃素-玉米黃素組分的含量為0.9‰。

2.5 舌狀花中全反式葉黃素組分含量

圖4 全反式葉黃素（A）和玉米黃素（B）參比樣品CC3300-HPPLLCC圖Fig.4 C30-HPLC profiles of all E-lutein （A） and E-zeaxanthin （B）

由圖4可見，保留時間為12.92 min的組分為全反式葉黃素，保留時間為14.23 min的組分為全反式玉米黃素。

圖5 油料葵花正己烷提取物皂化后CC3300-HHPPLLCC圖Fig.5 C30-HPLC profile of hexane extract from the ray florets of sunflower after saponification

樣品Ⅰ皂化后的C30-HPLC色譜圖見圖5。保留時間為12.94 min的組分與全反式葉黃素參比樣品中12.92 min的保留時間基本一致，故定性為全反式葉黃素。如圖5所示，樣品除全反式葉黃素外，還存在少量順式葉黃素和玉米黃素組分。根據色譜圖上全反式葉黃素、玉米黃素及其順式異構體組分峰面積，計算全反式葉黃素組分相對含量，樣品Ⅰ為88%，樣品Ⅱ為86%。全反式玉米黃素相對含量，樣品Ⅰ為8%，樣品Ⅱ為9%。按式（5）計算樣品中全反式葉黃素和玉米黃素組分的質量。經過對樣品的檢測，樣品中類胡蘿卜素（包括葉黃素）的含量見表1。樣品中全反式葉黃素的含量為樣品Ⅰ1.5‰，樣品Ⅱ0.8‰；全反式玉米黃素組分的含量為樣品Ⅰ0.14‰，樣品Ⅱ0.081‰。這一檢測結果顯示：樣品中玉米素組分的含量有限，不能做為玉米黃素的天然資源考慮。

表1 樣品中類胡蘿卜素含量Table 1 Carotenoid contents in samples‰

3 討 論

在本研究中，樣品采集的廣泛性有限。因此，得到的結論僅適用于樣品采集地的資源。在今后的工作中，應當在全國油葵的各主產區(qū)采集樣品，使樣品采集的方式和方法具有統(tǒng)計學意義。

結果顯示：伊犁-阿勒泰地區(qū)的油葵舌狀花樣品中全反式葉黃素的含量較內蒙包頭固陽地區(qū)的較高。其原因可能是多方面的，如環(huán)境和氣候條件差異是一個重要原因。尤其是日照強度和時間以及晝夜溫差的差異對油葵植株的次生代謝會產生較明顯的影響。

本研究采用紫外-可見光分光光度計檢測值為基礎的方法，HPLC檢測只提供各組分的相對比例。與直接用參比樣品在C30柱上做外標定量的方法相比，這種方法可最大限度地消除皂化、C30色譜柱保留等因素對檢測結果造成的影響。這種方法已在世界各國的國標方法中采用。

僅就本研究中采集樣品而言，與萬壽菊花中的葉黃素資源相比，其產地的油葵舌狀花中的葉黃素含量是有限的。因此，只有在資源量相當豐富，而且成本很低的條件下，二者產地的油葵舌狀花中的葉黃素才能被考慮成為葉黃素的新資源。

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Quantification of the Content of all E-lutein from the Ray Florets of Oil Sunflower in Xinjiang and Inner Mongolia

HUI Bodi， GONG Ping
（Department of Food Science， College of Applied Arts and Science， Beijing Union University， Beijing 100191， China）

This study aimed to determine the content of all E-lutein in the ray fl orets of oil sunfl ower cultured in Xinjiang (Sample Ⅰ) and Inner Mongolia (Sample Ⅱ), China for assessing its potential exploitation as a novel source of lutein. This effort may also form a solid base for increasing the industrial benefi ts of sunfl ower. In practice, the assessment was performed from determination by ultraviolet and visible (UV-VIS) spectroscopy while C18- and C30-high performance liquid chromatography (HPLC) were applied to measure the relative amount of all E-lutein. Data from this assessment suggested that the amounts of all E-lutein in samples Ⅰ and Ⅱ were 1.5‰ and 0.8‰, respectively. The ray fl orets of oil sunfl ower, a plentiful resource, can be considered as a potential source of lutein.

sunfl ower; ray fl oret; carotenoid; lutein; C18-HPLC; C30-HPLC

TS201.2

A

1002-6630（2015）16-0220-04

10.7506/spkx1002-6630-201516041

2014-11-01

惠伯棣（1959—），男，教授，博士，研究方向為類胡蘿卜素化學與生物化學。E-mail：bodi_hui@buu.edu.cn