李 利，孔 麗，張 寧，趙偉超，肖亦農(nóng)，李炳學(xué),*，韓曉日

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，土肥資源高效利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

耐酸耐膽鹽乳酸菌的鑒定及篩選

李 利1，孔 麗2，張 寧2，趙偉超2，肖亦農(nóng)1，李炳學(xué)1,*，韓曉日1

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，土肥資源高效利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

從自然發(fā)酵的酸奶中分離出2 株細(xì)菌，經(jīng)16S rDNA分子鑒定為L(zhǎng)actobacillus plantarum SN1和Lactobacillus rhamnosus SN6，并對(duì)其生長(zhǎng)曲線、產(chǎn)酸速率、耐酸耐膽鹽能力進(jìn)行了研究。L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6在2 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，16 h后達(dá)到穩(wěn)定期，其OD600nm值分別為8.47、7.43。L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6的產(chǎn)酸速率較快，ph值在8 h后就降到了4.2以下，48 h后降到3.3左右。L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6在ph 4的培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h后，其相對(duì)OD600nm值分別為49.29%、47.14%，具有較強(qiáng)的耐酸能力。L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6在0.3 g/L膽鹽質(zhì)量濃度下培養(yǎng)16 h后，相對(duì)OD600nm值分別為57.7%、69.48%；在0.6 g/L膽鹽質(zhì)量濃度下的相對(duì)OD600nm值分別為48.22%、29.56%，具有較強(qiáng)的耐膽鹽能力。結(jié)果表明：L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6是生長(zhǎng)性能好、產(chǎn)酸能力強(qiáng)、耐酸耐膽鹽的益生菌株。

乳酸菌；耐酸耐膽鹽；16S rDNA序列分析

乳酸菌是發(fā)酵葡萄糖，主要代謝終產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的總稱[1]，包括乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、肉桿菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬、漫游球菌屬、明串球菌屬、酒球菌屬、四聯(lián)球菌屬等[2]，具有促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收、降低血清膽固醇、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、激活機(jī)體免疫系統(tǒng)、改善食品風(fēng)味和預(yù)防癌癥等生理功能[3]，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品及醫(yī)療保健等與人類密切相關(guān)的領(lǐng)域中有很高的應(yīng)用價(jià)值[4]。自然界中乳酸菌種類很多，分布極廣，在乳制品、肉制品、水果、蔬菜及植物制品上都有發(fā)現(xiàn)，有些種類甚至存在于人體的口腔、胃腸中[5]。

分離自開菲爾粒的植物乳桿菌Lp27[6]，發(fā)酵酸肉的消化乳桿菌SR10[7]，奶豆腐的屎腸球菌M1-1、植物乳桿菌M1-2、乳酸片球菌M1-3[8]，人腸道的屎腸球菌、食竇魏斯氏菌、干酪乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌[9]、鼠李糖乳桿菌Lr10[10]，均具有降膽固醇的益生作用。分離自發(fā)酵食品和糞便的植物乳桿菌CCFM8661和干酪乳桿菌CCFM1566[11]，奶豆腐的鼠李糖乳桿菌M6-1[8]具有抗氧化能力。從風(fēng)干香腸中分離的明串珠菌既有去除膽固醇能力、又有抗氧化能力[12]。分離自開菲爾粒的乳酸乳球菌乳亞種hUCM 201[13]，人腸道的植物乳桿菌L2[14]對(duì)腸道細(xì)胞表現(xiàn)出了良好的黏附性。從酸菜中分離的植物乳桿菌[15]，傳統(tǒng)乳制品、仔豬糞便及雞腸道分離的短乳桿菌、糞腸球菌、嗜酸乳桿菌[16]對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等有害菌株，均有明顯的抑菌效果。分離自奶酪的植物乳桿菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群的功能[17]，分離自傳統(tǒng)乳制品中的保加利亞乳桿菌LJJ自溶活性較強(qiáng)[18]。

乳酸菌在人體內(nèi)發(fā)揮益生作用的前提是其可在人體腸道中存活并定殖，而乳酸菌能否在人體內(nèi)存活定殖主要與其耐酸耐膽鹽能力有關(guān)[19]。因此，耐酸耐膽鹽能力是篩選益生性乳酸菌的一個(gè)重要指標(biāo)[20]。本實(shí)驗(yàn)從自然發(fā)酵的酸奶中分離出2 株乳酸菌，并對(duì)其生長(zhǎng)曲線、產(chǎn)酸速率、耐酸耐膽鹽能力進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

酸奶是將鮮牛奶封閉于滅菌容器內(nèi)，經(jīng)37 ℃自然發(fā)酵1 d制成。Lactobacillus plantarum subsp. plantarum CGMCC 1.555、Lactobacillus brevis CGMCC 1.558、Lactobacillus acidophilus CGMCC 1.1878、Lactobacillus casei CGMCC 1.2435、Lactobacillus pentosus CGMCC 1.2439、Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.2466購(gòu)自中國(guó)普通微生物保藏管理中心。

MRS液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10.0、牛肉膏10.0、酵母粉5.0、葡萄糖20.0、檸檬酸二鈉2.0、吐溫-80 1.0、K2hPO42.0、乙酸鈉5.0、(Nh4)2SO41.63、MgSO40.58、MnSO40.25，ph值為6.5，115 ℃滅菌30 min。

DNA 2000 Marker 寶生物工程（大連）有限公司；2×Taq MasterMix 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；GoodView核酸染料 北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

TC-412型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 英國(guó)Techne公司；Bio-Rad universal hoodⅡ型凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；Lambda Bio35 紫外-可見分光光度計(jì) 美國(guó)Perkin Elme公司；GNP-9080型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；ph計(jì) 美國(guó)Orion公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離及初步鑒定

稱取5 g自制酸奶樣品，用45 mL無菌水均質(zhì)，然后做10 倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-63 個(gè)稀釋度，各稀釋度取0.1 mL液體分別涂布于固體MRS培養(yǎng)基平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48～72 h。根據(jù)形態(tài)特征挑選典型菌落，反復(fù)劃線獲得純菌株，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢和過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 乳酸菌16S rDNA分子鑒定

1.3.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

16S rDNA通用引物：7F：5’-CAGAGTTT GATCCTGGCT-3’；1540R：5’-AGGAGGTGA TCCAGCCGCA-3’。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.2.2 總DNA的提取[21]

取過夜培養(yǎng)的菌液1 mL置于1.5 mL EP管中，4 000 r/min離心5 min 后，棄上清收獲菌體。在沉淀物中加入100 μL裂解液（100 mmol/L Tris、30 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、0.5%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）），沸水浴15 min后，加入100 μL的2.5 mol/L醋酸鉀后，置于冰上30 min。再加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）劇烈振蕩后，12 000 r/min離心10 min，取上清加入等體積的冷的異丙醇，－20 ℃靜置15 min；13 000 r/min離心15 min；用100 μL 體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇洗滌沉淀，13 000 r/min離心5 min，用100 μL 無水乙醇再次洗滌沉淀，將沉淀置于真空干燥器中抽干，加入50 μL ddH2O溶解，即為DNA。將提取的DNA于－20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.3 PCR 擴(kuò)增

反應(yīng)體系為DNA模板1.5 μL；2×Taq MasterMix 12.5 μL；10 μmol/L 7F、1540R上下游引物各0.5 μL；加無菌水至總體積為25 μL。PCR條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，共35 個(gè)循環(huán)；第35個(gè)循環(huán)72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。按照以上條件設(shè)定程序，使用PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳

配制1%的瓊脂糖凝膠，以5∶1（V/V）的比例加入PCR產(chǎn)物和6×Loading buffer，在100 V電壓條件下電泳30 min，利用紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察與分析。最后，將PCR產(chǎn)物送到生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 乳酸菌生物學(xué)性質(zhì)研究

1.3.3.1 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將活化的菌株，按3%接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)36 h，每隔2 h取樣，在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品的光密度（OD）值，繪制生長(zhǎng)曲線圖。

1.3.3.2 產(chǎn)酸性實(shí)驗(yàn)

將活化的菌株，按3%接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)30 h，每隔2 h取樣測(cè)ph值。

1.3.3.3 耐酸性實(shí)驗(yàn)

將活化的菌株，按3%接種量接種于ph值分別為2.0、4.0、6.0、6.5和7.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)16 h，測(cè)各組菌液的OD600nm值。

1.3.3.4 耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

將活化后的菌株，按3%接種量接種于膽鹽質(zhì)量濃度分別為0、0.3、0.6 g/L的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)16 h，測(cè)各組菌液的OD600nm值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)的初步鑒定

從酸奶中共分離出2 株革蘭氏染色陽(yáng)性、過氧化氫酶陰性的桿菌，分別命名為SN1、SN6。菌落形態(tài)為乳白色或白色、表面光滑、邊緣整齊、大小不一的圓形菌落。細(xì)胞形態(tài)為短桿狀，一般呈單個(gè)、成對(duì)或鏈狀排列。

2.2 乳酸菌16S rDNA基因序列分析

圖1 分離株16S rDNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of PCR-amplified 16S rDNA gene fragmentsfrom two isolates

由圖1可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分離株在1 500 bp處均出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期擴(kuò)增大小一致，說明擴(kuò)增成功。

測(cè)序后，將各菌株的16S rDNA基因測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST分析，各菌株與參考菌株的同源性均達(dá)到99%以上（表1）。為顯示菌株之間的親緣關(guān)系及系統(tǒng)地位，MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。

表1 16SrDNA序列的BLAST分析結(jié)果Table 1 16S rDNA sequence analysis results of BLAST

圖2 分離株16S rDNA 序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of two isolates

如圖2所示，分離株中1 株與L. plantarum有較近親緣性，1 株與L. rhamnosus有較近的親緣性，且與相似菌株的相似性達(dá)到100%，故SN1鑒定為L(zhǎng). plantarum（NCBI登錄號(hào)為KP296678），SN6鑒定為L(zhǎng). rhamnosus（NCBI登錄號(hào)為KP296679）。

2.3 乳酸菌生物學(xué)性質(zhì)

2.3.1 乳酸菌生長(zhǎng)曲線

圖3 乳酸菌的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curves of lactic acid bacteria

由圖3可知，各菌株生長(zhǎng)迅速，L. plantarum subsp. plantarum CGMCC 1.555、L. rhamnosus CGMCC 1.2466、L. plantarum SN1、L. rhamnosus SN6、L. casei CGMCC 1.2435在2 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，L. plantarum subsp. plantarum CGMCC 1.555在12 h后達(dá)到穩(wěn)定期；L. rhamnosusCGMCC 1.2466在14 h后達(dá)到穩(wěn)定期，SN1、SN6在16 h后達(dá)到穩(wěn)定期，L. casei CGMCC 1.2435在18 h后達(dá)到穩(wěn)定期。L. pentosus CGMCC 1.2439在4 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，16 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。L. brevis CGMCC 1.558在6 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，14 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。L. acidophilus CGMCC 1.1878在10 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，16 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。

L. plantarum SN1、L. rhamnosus SN6、L. pentosus CGMCC 1.2439、L. rhamnosus CGMCC 1.2466、L. casei CGMCC 1.2435、L. plantarum subsp. plantarum CGMCC 1.555、L. brevis CGMCC 1.558、L. acidophilus CGMCC 1.1878對(duì)數(shù)期的OD600nm值分別為8.47、7.43、6.93、6.76、4.67、3.94、2.09、1.43。

2.3.2 產(chǎn)酸性實(shí)驗(yàn)

產(chǎn)酸速率是乳酸菌活力良好的重要特征之一，也是篩選優(yōu)良菌株的重要指標(biāo)。由圖4可知，L. rhamnosus 1.2466和L. plantarum SN1、L. rhamnosus SN6產(chǎn)酸最快，8 h后ph值降到4.2以下；L. plantarum subsp. plantarum CGMCC 1.555、L. pentosus CGMCC 1.2439在10 h后ph值下降到4.2以下；L. casei CGMCC 1.2435在12 h后下降到4.2，L. brevis 1.558、L. acidophilus CGMCC 1.1878產(chǎn)酸相對(duì)較慢，36 h后ph值下降到4以下。以上菌株顯示了較好的產(chǎn)酸能力。

圖4 乳酸菌的產(chǎn)酸性Fig.4 Acid production rates of lactic acid bacteria

2.3.3 耐酸性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 乳酸菌在不同pH值培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h后的OD600nm值Fig.5 OD600nmvalues of lactic acid bacteria cultivated in media at different pHs for 16 h

由圖5可知，L. acidophilus CGMCC 1.1878、L. pentosus CGMCC 1.2439、L. plantarum SN1在培養(yǎng)基ph值為6.0時(shí)OD600nm值最大，L. plantarum subsp. plantarum CGMCC 1.555、L. brevis CGMCC 1.558、L. casei CGMCC 1.2435、L. rhamnosus CGMCC 1.2466在培養(yǎng)基ph值為6.5時(shí)OD600nm值最大，而L. rhamnosus SN6在ph值為6.0和6.5時(shí)均達(dá)到了最大的生長(zhǎng)量，說明培養(yǎng)基在ph 6.0左右為各菌株的最佳培養(yǎng)條件。 ph 2.0的培養(yǎng)基中各菌株基本不生長(zhǎng)；在ph 4.0的培養(yǎng)基中，L. plantarum subsp. plantarum CGMCC 1.555、L. brevis CGMCC 1.558、L. acidophilus CGMCC 1.1878、L. casei CGMCC 1.2435、L. pentosus CGMCC 1.2439、L. rhamnosus CGMCC 1.2466、SN1、SN6的相對(duì)OD600nm分別為3.98%、31.91%、13.58%、31.50%、56.53%、45.98%、49.29%、47.14%。綜上結(jié)果，L. plantarum SN1、L. rhamnosus SN6均較參考菌株的相對(duì)OD600nm值高，說明L. plantarum SN1、L. rhamnosus SN6具有較強(qiáng)的耐酸能力。

2.3.4 耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

耐膽鹽能力是乳酸菌的重要特征之一，乳酸菌要到達(dá)并定殖于腸道，必須對(duì)膽鹽有一定的耐受性。由圖6可知，隨著膽鹽質(zhì)量濃度的升高，各菌株的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制。將菌株在0.3 g/L的膽鹽質(zhì)量濃度下培養(yǎng)16 h后，與培養(yǎng)基中沒添加膽鹽的OD600nm值相比，L. plantarum subsp. plantarum 1.555、 L. brevis 1.558、L. acidophilus 1.1878、L. casei 1.2435、 L. pentosus 1.2439、L. rhamnosus 1.2466、L. plantarum SN1、L. rhamnosus SN6的相對(duì)OD600nm值分別為12.81%、57.31%、34.00%、53.40%、53.66%、89.02%、57.70%、69.48%；在0.6 g/L的膽鹽質(zhì)量濃度下培養(yǎng)16 h后，與培養(yǎng)基中沒添加膽鹽的OD600nm值相比，各菌株相對(duì)OD600nm值分別為3.31%、48.84%、14.33%、 28.53%、 35.58%、27.36%、48.22%、29.56%。與參考菌株相比，L. plantarum SN1、L. rhamnosus SN6具有較強(qiáng)的耐膽鹽能力。

圖6 乳酸菌在不同膽鹽含量培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h后的OD600nm值Fig.6 OD600nmvalues of lactic acid bacteria cultivated in media with different bile salt concentrations for 16 h

3 結(jié)論與討論

酸奶經(jīng)自然發(fā)酵會(huì)保留許多具有優(yōu)良特性的乳酸菌，如植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、干酪乳桿菌、戊糖乳桿菌、消化乳桿菌、詹氏乳桿菌、耐酸乳桿菌、德氏乳桿菌、玉米乳桿菌、糞腸球菌、嗜熱鏈球菌、植物乳球菌和腸膜明串珠菌[22-23]。鼠李糖乳桿菌多分離于人的糞便[24-25]、人群腸道[10]、乳酪[26]、以及發(fā)酵橄欖[27]等。本研究從自然發(fā)酵的酸奶中分離到2 株細(xì)菌，進(jìn)行革蘭氏染色、過氧化氫酶及16S rDNA鑒定為L(zhǎng). plantarum SN1和L. rhamnosus SN6。

乳酸菌作為發(fā)酵劑被廣泛應(yīng)用到食品行業(yè)，如酸奶、奶酪、風(fēng)干香腸、酸菜等的生產(chǎn)。在發(fā)酵初期，乳酸菌快速生長(zhǎng)且能夠足量的產(chǎn)酸，使ph值迅速降低，這不僅對(duì)產(chǎn)品色澤的形成有促進(jìn)作用，還能夠提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性[28-29]和安全性[30]。本研究通過生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸速率指標(biāo)篩選出生長(zhǎng)迅速、產(chǎn)酸較快L. plantarum SN1、L. rhamnosus SN6初步可作為具有潛在發(fā)酵特性的菌株。

乳酸菌作為益生菌能否在人體內(nèi)發(fā)揮益生作用，關(guān)鍵在于其能否在胃液的酸性環(huán)境和腸道的膽鹽環(huán)境中存活下來。正常人的胃液在ph 1.5～4.5之間，其ph值的大小因食物結(jié)構(gòu)不同而波動(dòng)[31]。在ph 2.0時(shí)，所有菌株基本不生長(zhǎng)；在ph 4.0時(shí)，各菌株均表現(xiàn)出不同程度的耐受性，L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6相對(duì)OD600nm值分別為49.29%、47.14%，且均較參考菌株的相對(duì)OD600nm值高，說明L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6具有較強(qiáng)的耐酸能力。這種耐酸特性是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，包括雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、維持胞內(nèi)外ph值平衡，細(xì)胞膜組成變化，蛋白質(zhì)、DNA 損傷修復(fù)等[5]。

L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6具有較強(qiáng)的耐酸能力，能夠保證一定數(shù)量的活菌體順利通過胃酸環(huán)境到達(dá)腸道內(nèi)。人體小腸中膽鹽質(zhì)量濃度在0.3～3 g/L之間波動(dòng)，能夠在正常生理膽鹽質(zhì)量濃度中生長(zhǎng)和代謝的菌株才可能在腸道消化過程中存活[32]。本研究中L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6在0.3 g/L膽鹽質(zhì)量濃度下培養(yǎng)16 h后，相對(duì)OD600nm值分別為57.7%、69.48%； 在0.6 g/L膽鹽質(zhì)量濃度下的相對(duì)OD600nm值分別為48.22%、29.56%，均表現(xiàn)出一定的耐受力，且均較參考菌株的相對(duì)OD600nm值高，由此可見，L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6具有較強(qiáng)的耐膽鹽能力。耐膽鹽特性主要與自身的膽鹽水解酶、表層蛋白有關(guān)[5]。

乳酸菌作為益生菌對(duì)人體具有重要的生理功能，它對(duì)胃腸道的耐受性是其發(fā)揮生理功能的基本前提。本研究所鑒定的兩株乳酸菌有較強(qiáng)的耐酸耐膽鹽能力，具有在人體內(nèi)定殖的潛力，可以廣泛應(yīng)用在酸奶、豆類、谷物等乳酸發(fā)酵制品中，也可應(yīng)用在發(fā)酵肉制品、青貯飼料中。目前，對(duì)于乳酸菌耐酸耐膽鹽機(jī)制的研究已有諸多報(bào)道，但尚不完全清楚[5]。本課題組將運(yùn)用同源基因克隆方法研究L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6中的膽鹽水解酶基因等，深入分析其耐酸耐膽鹽的機(jī)制。

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Identification and Selection of Lactic Acid Bacteria Resistant to Acid and Bile Salt

LI Li1, KONG Li2, ZHANG Ning2, ZHAO Weichao2, XIAO Yinong1, LI Bingxue1,*, HAN Xiaori1
(1. National Engineering Laboratory for Efficient Utilization of Soil and Fertilizer Resources, College of Land and Environment, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2. College of Biological Science and Technology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Two strains of lactic acid bacteria were isolated from naturally fermented yogurt. The 16S rDNA sequence analysis indicated that the two strains were Lactobacillus plantarum SN1 and Lactobacillus rhamnosus SN6. These strains were studied for growth curve, acid production rate, acid and bile salt tolerance. Both of them reached a logarithmic growth phase after 2 h and a stable period after 16 h with OD600nmvalues of 8.47 and 7.43, respectively. The pH value dropped to 4.2 at 8 h and 3.3 at 48 h. L. plantarum SN1 and L. rhamnosus SN6 had strong resistance to acid, and the relative OD600nmvalue was 49.29% and 47.14% at pH 4.0 after 16 h of culture, respectively. After being cultured for 16 h at a bile salt concentration of 0.3 g/L, the relative OD600nmvalues of L. plantarum SN1 and L. rhamnosus SN6 were 57.7% and 69.48%, respectively, compared to 48.22% and 29.56% when the concentration of bile salt was 0.6 g/L. These results show that both L. plantarum SN1 and L. rhamnosus SN6 are probiotic strains with strong growth performance, acid production and tolerance to acid and bile salt.

lactic acid bacteria; acid and bile salt tolerance; 16S rDNA sequence analysis

Q935

A

1002-6630（2015）21-0123-06

10.7506/spkx1002-6630-201521024

2015-01-05

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271818）；沈陽(yáng)市科技創(chuàng)新農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)專項(xiàng)（F13-143-3-00）；

中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（2012M510836；2013T60299）

李利（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锷砼c遺傳。E-mail：lili2008aa@163.com

*通信作者：李炳學(xué)（1973—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锷砼c遺傳。E-mail：libingxue1027@163.com