HPLC-MS/MS法測定巢湖水產(chǎn)品中抗生素殘留量

王華章1，王晨晨2，唐 俊2

(1.安徽省合肥市長豐縣環(huán)境保護(hù)局，安徽長豐 231199；2．安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，安徽合肥 230036)

摘要[目的]了解巢湖湖區(qū)魚蝦體內(nèi)抗生素的殘留現(xiàn)狀。[方法]從湖區(qū)漁船和岸邊集市采集魚蝦樣品22份，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行抗生素檢測。[結(jié)果]磺胺類、喹諾酮類和四環(huán)素類15種抗生素共有5種抗生素被檢出，分別為磺胺嘧啶、磺胺氯達(dá)嗪、洛美沙星、恩洛沙星和氧氟沙星，平均濃度為0.21～1.94 μg/kg，均未超過食品中抗生素限量標(biāo)準(zhǔn)。22份樣品中檢出抗生素較多的是河蝦、白米蝦和鯉魚等底棲雜食性魚類。[結(jié)論]巢湖湖區(qū)水產(chǎn)品中抗生素殘留水平較低，符合食品安全標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞抗生素；魚；蝦；殘留；巢湖；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

中圖分類號S851.34+7

作者簡介王華章(1980-)，男，安徽長豐人，助理工程師，從事環(huán)境監(jiān)測與環(huán)境管理。

收稿日期2015-06-29

Investigation of Antibiotics Residue in Aquatic Food in Chaohu Lake by HPLC-MS/MS

WANG Hua-zhang1, WANG Chen-chen2, TANG Jun2(1. Agency of Environment Protection of Changfeng County, Changfeng, Anhui 231199; 2. School of Resources and Environment, Anhui Agricultural University, Hefei, Anhui 230036)

Abstract[Objective] To investigate the residue of antibiotics in aquatic food in Chaohu Lake, China. [Method] Antibiotics were detected by HPLC-MS/MS in 22 samples of fish and shrimp collected form fishing ship and fish market besides Chaohu Lake. [Result] Sulfadiazine, sulfachoropyridazine, lomefloxacin, enrofloxacin and ofloxacin were quantified among 15 antibiotics with concentrations ranged from 0.21 to 1.94 μg/kg. Fortunately, concentrations of antibiotics in fish and shrimp were not excess the residue standards of antibiotics in aquatic food. Cyprinus carpio, Leander modestus Heller and Macrobrachium nipponense which live in bottom of Chaohu Lake had higher detected frequencies among all samples. [Conclusion] Aquatic food in Chaohu Lake had a low level of antibiotics residue and could meet the national food safety standard.

Key words Antibiotics; Fish; Shrimp; Residue; Chaohu Lake; HPLC-MS/MS

我國是抗生素最大生產(chǎn)國和消費(fèi)國，抗生素使用后大多數(shù)不能被生物體完全吸收利用[1]，大部分以原藥或代謝產(chǎn)物(氧化產(chǎn)物、共軛態(tài)、水解產(chǎn)物等)形式隨糞便和尿液等排泄物排入水體等環(huán)境中，由于其持續(xù)性地進(jìn)入使水體已經(jīng)成為環(huán)境中抗生素最重要的歸宿地之一[2]。我國陸續(xù)在長江三角洲、渤海、香港維多利亞港和珠江廣州河段等水域檢測出磺胺、四環(huán)素、喹諾酮類等多類抗生素殘留[3-8]。水中抗生素可通過食物鏈形式進(jìn)入水生動物體內(nèi)進(jìn)行富集[9]，水產(chǎn)品中抗生素殘留是危害人體健康的因素之一[10]。近年來，我國在水產(chǎn)品中屢次發(fā)生抗生素污染事件[11-16]，由于抗生素的濫用從而導(dǎo)致的水產(chǎn)品污染問題越發(fā)嚴(yán)重。巢湖是我國第五大淡水湖，由于流域內(nèi)畜禽養(yǎng)殖及城市排水的影響，水質(zhì)較差。研究表明，巢湖漁業(yè)資源有減少的趨勢，并且與水質(zhì)惡化有直接的關(guān)系[17]。目前有針對巢湖白米蝦中重金屬污染現(xiàn)狀的調(diào)查研究[18]，而有關(guān)巢湖魚蝦中抗生素污染現(xiàn)狀的研究尚未見報(bào)道。筆者對巢湖湖區(qū)野生魚蝦等水產(chǎn)品中磺胺類、喹諾酮類和四環(huán)素類15種抗生素進(jìn)行了測定，旨在探討魚蝦中抗生素殘留現(xiàn)狀，為巢湖水產(chǎn)品的安全性評價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集樣品于2012年9月和2013年1月采自巢湖湖面魚蝦捕撈作業(yè)船只及忠廟碼頭集市，均為新鮮樣品，共22份。其中，魚樣品種有鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳡魚(Elopichthysbambusa)、鲇魚(Silurusasotus)、鳙魚(Aristichthysnobilis)、鯉魚(Cyprinuscarpio)、鳊魚(Parabramispekinensis)、鯽魚(Carassiusauratus)、刀鱭(Coiliaectenes)、翹嘴鲌(Culteralburnus)、太湖新銀魚(Neosalanxtaihuensis)、大銀魚(Protosalanxhyalocranius)、馬口魚(Opsariichthysuncirostrisbidens)、間下鱵魚(Hyporhamphusintermedius)；蝦樣品種有白米蝦(LeandermodestusHeller)及河蝦(Macrobrachiumnipponense)。樣品采集后立即放入聚四氟乙烯塑料袋中密封并冷藏，2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室處理。

1.2儀器與設(shè)備超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(Xevo TQ MS，美國Waters公司)；超聲波清洗器(KQ-5200型，昆山市超聲儀器有限公司)；高速組織搗碎機(jī)(德國IKA公司)；水浴振動器(SHZ-82型，金壇市醫(yī)療器械廠)；氮吹儀(N-EVAPTM112，Organomation Associates, Jnc)；pH計(jì)(PHS-3C型，上海精密科學(xué)儀器有限公司)；電子天平(FA2104A型，上海精天儀器有限公司。

1.3試劑與材料乙二胺四乙酸二鈉，分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二氯甲烷、甲醇、正己烷、甲酸、鹽酸均為色譜純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磺胺嘧啶(Sulfadiazine，SDZ)、磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole，SMZ)、磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine，SM2)、磺胺氯噠嗪(Sulfachoropyridazine，SCP)、磺胺間二甲氧嘧啶 (Sulfadimethoxine，SDM) 、諾氟沙星(Norfloxacin，NOR)、氧氟沙星(Ofloxacin, OFX)、雙氟沙星(Difloxacin, DIF)、洛美沙星(Lomefloxacin, LOM)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin, CIP)、恩諾沙星(Enrofloxacin, ENR)，純度均不低于99%，購自Sigma公司；四環(huán)素(Tetracycline，TC)、土霉素(Oxytetracycline，OTC)、金霉素(Chlorteracycline， CTC)、強(qiáng)力霉素(Doxycycline， DOC)標(biāo)準(zhǔn)品，純度不低于95%，購自BIO BASIC INC公司。用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解配成0.5 g/L儲備液，置于棕色容量瓶中避光4 ℃條件下保存，臨用時(shí)根據(jù)需要稀釋成適當(dāng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4樣品的預(yù)處理鰱魚、鳙魚等大型魚先將魚體表面雜質(zhì)洗凈，去掉鱗、內(nèi)臟，取肉(包括脊背和腹部)和皮一起，放入高速組織搗碎機(jī)中均質(zhì)；太湖新銀魚等小型魚棄去頭部及魚鰭，放入高速組織搗碎機(jī)中均質(zhì)；蝦樣去其頭和殼后放入高速組織搗碎機(jī)中均質(zhì)。樣品混合均勻后，裝入清潔容器內(nèi)，并標(biāo)明標(biāo)記。

稱取2.0 g(精確至0.01 g)樣品于50 ml聚乙烯離心管中，加入20 ml乙腈-二氯甲烷(95∶5，V/V)混合溶劑，于渦旋振蕩器振蕩提取2 min后置于超聲波清洗器中超聲提取10 min，再置于水平振蕩器上振搖提取15 min，4 500 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至150 ml濃縮瓶中。重復(fù)提取1次，合并提取液，然后在40 ℃下旋轉(zhuǎn)濃縮至近干。用5 ml甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 ml容量瓶中，N2吹干后準(zhǔn)確加入2.0 ml 15%甲醇水溶液并超聲助溶，用2 ml正己烷萃取雜質(zhì)，棄去正己烷后過0.22 μm濾膜，待測定。

1.5試驗(yàn)方法

1.5.1色譜條件。 色譜柱：ACQUITY UPLC? BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm；流速：0.15 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl；流動相A:甲醇/水(V/V為2∶98)+0.1%甲酸；流動相B:甲醇+0.1%甲酸，流動相采用梯度洗脫,具體如表1所示。

表1　 UPLC-ESI-MS/MS系統(tǒng)流動相梯度洗脫條件

1.5.2 質(zhì)譜條件。電離方式：ESI+； 毛細(xì)管電壓：3 kV；離子源溫度：150 ℃；錐孔反吹氣流量：50 L/h；脫溶劑氣溫度：400 ℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；監(jiān)測模式為MRM模式，離子監(jiān)測條件具體見表2。

1.5.3方法學(xué)驗(yàn)證。為了消除樣品基質(zhì)效應(yīng)，以空白樣品提取液為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋溶液，將3類抗生素混合溶液逐級稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測定，采用外標(biāo)法定量。以各組分的峰面積(Y)對質(zhì)量濃度(X，μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到15種抗生素的線性方程。

1.5.4魚蝦中抗生素殘留量的測定。采用建立的HPLC-MS/MS方法測定巢湖魚蝦中15種抗生素的殘留量。

2 結(jié)果與分析

2.1方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果由表3可知，在0.5～100 μg/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.995。以信噪比S/N=10，計(jì)算定量限(LOQ)為0.14～11.64 μg/kg。采用不含抗生素的空白樣品進(jìn)行25和250 μg/kg的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)5次，15種抗生素的回收率為58%～107%，變異系數(shù)為2.3%～15.3%，說明該方法具有較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

表2　 目標(biāo)抗生素的質(zhì)譜監(jiān)測參數(shù)

注：*為定量子離子。

表3　魚蝦中15種抗生素回收率和定量限

2.2巢湖魚蝦中抗生素的殘留量由表4可知，15種抗生素中磺胺類和沙星類有5種被檢出，分別為磺胺嘧啶、磺胺氯達(dá)嗪、洛美沙星、恩洛沙星、雙氟沙星和氧氟沙星，平均濃度范圍為0.21～1.94 μg/kg。4種四環(huán)素類抗生素均未檢出。從檢出樣品來看，白米蝦、河蝦、馬口魚、鯉魚、刀鱭、鯽魚、鳙魚有抗生素檢出，且白米蝦、河蝦、鯉魚檢出率較高，說明巢湖中這3種水生動物體內(nèi)易富集抗生素。水體底泥是大部分污染物的富集區(qū)，而蝦類和鯉魚都是喜棲息在湖底淤泥部分，同時(shí)鯉魚是雜食性魚類，喜食底棲動物或底泥中的有機(jī)物，因此其體內(nèi)抗生素含量較高。

參照我國《無公害水產(chǎn)品中漁藥殘留限量》(NY5070-2002)規(guī)定，各種抗生素的殘留濃度上限為：磺胺類抗生素總

和為100 μg/kg，恩諾沙星為100 μg/kg，洛氟沙星和環(huán)丙沙星為50 μg/kg，四環(huán)素類為100 μg/kg。若氧氟沙星和雙氟沙星參照50 μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)。由表4可知，巢湖魚蝦中檢出抗生素濃度最高為1.94 μg/kg，殘留量均不超過標(biāo)準(zhǔn)。

表4　巢湖魚蝦體中抗生素的檢測結(jié)果

注:ND表示未檢出或低于檢出限；磺胺類藥物總和標(biāo)準(zhǔn)值為100。

3小結(jié)

巢湖魚蝦體內(nèi)抗生素含量總體較低，共檢出磺胺嘧啶、磺胺氯達(dá)嗪、洛美沙星、恩洛沙星、洛美沙星和氧氟沙星5種抗生素，平均濃度為0.21～1.94 μg/kg，殘留濃度均未超過限量標(biāo)準(zhǔn)。底棲和雜食性為主的河蝦、白米蝦和鯉魚檢出抗生素較多，說明底棲活動水生動物體內(nèi)易富集抗生素。

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