劉妙，楊憲時(shí)，李學(xué)英，遲海，黃洪亮

1(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海，200090)2(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海，201306)

魷魚(yú)(squids)，也稱槍烏賊、柔魚(yú)，是軟體動(dòng)物門頭足綱槍形目槍烏賊科的總稱。我國(guó)每年魷魚(yú)捕獲量達(dá)到36～43萬(wàn)t，占據(jù)世界魷魚(yú)捕獲量的36%左右，是我國(guó)重要的遠(yuǎn)洋捕撈經(jīng)濟(jì)動(dòng)物［1］。魷魚(yú)具有高蛋白、低脂肪、低熱量的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還富含鈣、?；撬?、磷、VB1等多種人體所需的營(yíng)養(yǎng)成分，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值毫不遜色于牛肉和金槍魚(yú)［2］。

對(duì)于魷魚(yú)來(lái)說(shuō)，冷凍保藏是最主要的保藏方法，能在長(zhǎng)期貯藏中極大地保持魷魚(yú)的品質(zhì)。冷凍環(huán)境下不僅可以降低魷魚(yú)蛋白內(nèi)部自身的各類生化反應(yīng)速率，還可以降低微生物的繁殖速率［3］。但是冷凍保藏容易使魚(yú)肉蛋白發(fā)生冷凍變性，使魚(yú)肉的持水性、膠凝性、口感和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值都產(chǎn)生不良的變化。在水產(chǎn)品中加入保鮮劑可以有效防止蛋白質(zhì)變性，延長(zhǎng)魷魚(yú)的保質(zhì)期。普通的保鮮劑性能單一，保鮮效果具有一定的局限性。復(fù)合保鮮劑是當(dāng)前保鮮劑研究的主要方向之一，但是復(fù)合保鮮劑對(duì)凍藏魷魚(yú)的保鮮效果的研究還很少。路鈺希等［3］選取了D-山梨醇、乳酸鈉、三聚磷酸鹽、混合磷酸鹽和海藻糖5種保鮮劑，探討了單一保鮮劑對(duì)凍藏條件-20℃下魷魚(yú)品質(zhì)變化的影響。本研究在該保鮮劑單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取保鮮效果較好的海藻糖、乳酸鈉、混合磷酸鹽進(jìn)行各種比例復(fù)配，以持水率(WHC)、鹽溶性蛋白質(zhì)含量(SSP)、活性巰基含量為指標(biāo)，并結(jié)合色差試驗(yàn)和質(zhì)構(gòu)，分析魷魚(yú)在-20℃凍藏條件下的品質(zhì)變化。旨在篩選出較優(yōu)配比的復(fù)合保鮮劑來(lái)提高魷魚(yú)質(zhì)量，延長(zhǎng)魷魚(yú)的貨架期，為魷魚(yú)保鮮劑的開(kāi)發(fā)提供基本的數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

魷魚(yú)為2013年9月在經(jīng)緯度為155°42'E，42°55'N的公海區(qū)域捕撈的北太平洋魷魚(yú)，船上凍結(jié)后貯藏-20℃運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，-80℃貯藏備用。

海藻糖、乳酸鈉、混合磷酸鹽［m(三聚磷 酸鈉)∶m(焦磷 酸鈉)∶m(六偏磷 酸鈉)=2∶2∶1］、考馬斯亮藍(lán) G-250、5，5’二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、三羥甲基氨基甲烷、牛血清蛋白、無(wú)水乙醇、H3PO4、KCl、KH2PO4、NaOH、HCl等，試劑均為分析純或化學(xué)純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

JYL-350絞肉機(jī)，上海九陽(yáng)股份有限公司;IUL均質(zhì)機(jī)，西班牙;5810R高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf德國(guó);CR-400色差儀，CHROMA METER日本;TMS-Pro質(zhì)構(gòu)儀，F(xiàn)ood Technology Corporation美國(guó);721可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司;HH-8恒溫水浴鍋;MPR-414F冰箱，Sanyo日本;YP200N電子天平，上海菁海儀器有限公司。

1.2 樣品處理與貯藏實(shí)驗(yàn)

魷魚(yú)從-80℃冰箱中取出，流水解凍。去除頭部、內(nèi)臟和皮，取胴體切塊備用。將各組樣品放入對(duì)應(yīng)濃度的復(fù)配保鮮劑中浸漬10 min，復(fù)配保鮮劑溶液與魷魚(yú)比例(mL∶g)為 2∶1［4］，對(duì)照組在蒸餾水中浸漬10 min。取出魷魚(yú)瀝干，根據(jù)保鮮劑濃度依次放入保鮮袋中，貯藏于(-20±0.1)℃冰箱中。每隔10 d隨機(jī)抽樣進(jìn)行持水率、鹽溶性蛋白質(zhì)含量、活性巰基含量、色差和最大剪切力測(cè)定，共貯藏60 d。測(cè)定時(shí)將凍藏魷魚(yú)流水解凍。

保鮮劑的添加量均符合GB 2760-2011食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，復(fù)配保鮮劑溶液添加水平如表1所示。

表1 魷魚(yú)復(fù)配保鮮劑L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Design of squid complex fresh-keeping orthogonal experiment L9(34)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 正交試驗(yàn)

選用海藻糖、乳酸鈉和混合磷酸鹽，以持水力、鹽溶性蛋白質(zhì)含量、活性巰基含量為測(cè)試指標(biāo)，按公式(1)和公式(2)進(jìn)行評(píng)分。并采用三因素三水平L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)(表2)，同時(shí)進(jìn)行方差分析，根據(jù)分析結(jié)果確定復(fù)配保鮮劑的最佳配比。

式中:指標(biāo)值為某次測(cè)量的實(shí)際值;指標(biāo)最小值為該指標(biāo)所有測(cè)量結(jié)果中的最小值;指標(biāo)最大值為該指標(biāo)所有測(cè)量結(jié)果中的最大值。

1.3.2 持水率的測(cè)定

［5］略作修改，采用加壓重量法，對(duì)魷魚(yú)的持水率進(jìn)行測(cè)定。取1 cm厚質(zhì)量約為10 g的肉塊，上下各墊10層濾紙，用TMS-Pro質(zhì)構(gòu)儀，35 kg壓力壓5 min，壓完后稱其質(zhì)量，計(jì)算持水率［公式(3)］:

式中:m為加壓前樣品的質(zhì)量，g;m1為加壓后樣品的質(zhì)量，g。

1.3.3 鹽溶性蛋白含量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)［6］作適當(dāng)修改，用絞肉機(jī)把魷魚(yú)絞碎，取4 g裝入均質(zhì)袋中，加入10倍量的冰冷的0.6 mol/L 的KCl溶液，pH 7.2，均質(zhì)2 次，每次30 s，在4℃下提取2 h，然后離心(8 000 r/min，20 min，4 ℃)。收集上清液，加入3倍量的冷水再次離心(8 000 r/min，20 min，4℃)，所得上清液即為鹽溶性蛋白溶液。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，用牛血清蛋白測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.005 7x+0.014 4，R2=0.998 3)，計(jì)算結(jié)果以mg/g表示，每組試驗(yàn)做3個(gè)平行。

1.3.4 肌動(dòng)球蛋白的提取

肌動(dòng)球蛋白根據(jù)MacDonald等的方法制備。取絞碎后的魷魚(yú)肉4 g，裝入均質(zhì)袋中，加入40 mL冰冷的(4℃)0.6 mol/L的 KCl溶液，pH 7.0。均質(zhì)4 min，每均質(zhì)20 s，放在冰中間歇20 s，防止均質(zhì)過(guò)熱。然后離心(8 000 r/min，30 min，0 ℃)，收集上清液加入3倍量的冰冷的去離子水稀釋肌動(dòng)球蛋白。再離心(8 000 r/min，20 min，0 ℃)，所得沉淀加入等量的冰冷的1.2 mol/L的KCl溶液，pH 7.0，在0℃下攪拌 30 min，不溶部分再次離心(8 000 r/min，20 min，0℃)［7］。所得肌動(dòng)球蛋白溶液用0.6 mol/L KCl溶液調(diào)節(jié)到4 mg/mL，冷藏備用。

1.3.5 活性巰基含量的測(cè)定

參照 Benjakul和 Ellman等［7］方法，采用 DTNB法測(cè)定活性巰基含量。取1mL的4 mg/mL肌動(dòng)球蛋白溶液，加入9 mL 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH 6.8。取4 mL混合物，加入0.4 mL 0.1%5，5’二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)溶液，在40℃下反應(yīng)25 min，溶液在412 nm下測(cè)定吸光值?？瞻子?.6 mol/L KCl溶液代替。每組試驗(yàn)做3個(gè)平行?；钚詭€基含量按公式(4)計(jì)算:

式中:c0為巰基的摩爾濃度，mol/g;A為吸光值;D為稀釋倍數(shù);ε為吸光系數(shù)，L/mol·cm;c為蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.6 色差的測(cè)定

取完整肉塊，用色差儀測(cè)定樣品的 L*、a*、b*值。其中，L*表示亮度;+a*表示紅，-a*表示綠;+b*表示黃，-b*表示藍(lán)。每組樣品測(cè)定10次。

1.3.7 剪切力的測(cè)定

取1 cm寬1 cm厚的魷魚(yú)條，采用TMS-Pro型質(zhì)構(gòu)儀，通過(guò)Texture Lab Pro軟件測(cè)定魷魚(yú)的剪切力。最大力量感應(yīng)量程:1 000 N，回程距離:20 mm，測(cè)試速度:60 mm/min，每組樣品測(cè)定10次。

1.4 數(shù)據(jù)分析和處理方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 復(fù)配保鮮劑最佳配比的確定

魷魚(yú)復(fù)配保鮮劑正交試驗(yàn)結(jié)果及結(jié)果分析如表2、表3所示。由表2可知，所選的3種保鮮劑對(duì)魷魚(yú)保鮮效果主次作用為:A＞B＞C，即海藻糖＞乳酸鈉＞混合磷酸鹽。方差分析結(jié)果如表3所示，海藻糖和乳酸鈉的添加量對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果有極顯著的影響(P＜0.01)，混合磷酸鹽的添加量對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響(P＜0.05)。

表2 魷魚(yú)復(fù)配保鮮劑正交試驗(yàn)L9(34)第60天試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of squid complex fresh-keeping agents orthogonal experiment L9(34)at the 60thday

表3 魷魚(yú)復(fù)配保鮮劑正交試驗(yàn)L9(34)第60天結(jié)果的方差分析Table 3 Variance analysis of squid complex fresh-keeping agents orthogonal experiment L9(34)at the 60thday

以綜合評(píng)分作為總指標(biāo)進(jìn)行直觀分析得出7號(hào)試驗(yàn)(A3B3C2)效果最好，即海藻糖5%，乳酸鈉6%，混合磷酸鹽0.4%。在本實(shí)驗(yàn)中綜合分越大越好，各因素應(yīng)取最大K值所對(duì)應(yīng)的水平，即A3B3C3，海藻糖5%，乳酸鈉6%，混合磷酸鹽0.5%。該方案不包括在9組試驗(yàn)中，所以對(duì)直觀分析最優(yōu)組(A3B3C2)和方差分析最優(yōu)組(A3B3C3)進(jìn)一步做驗(yàn)證試驗(yàn)，對(duì)魷魚(yú)添加保鮮劑后分別凍藏60 d，試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。從表4可以看出，方差分析最優(yōu)組(A3B3C3)優(yōu)于直觀分析最優(yōu)組(A3B3C2)，因此復(fù)配保鮮劑最佳組合為A3B3C3，即海藻糖5%，乳酸鈉6%，混合磷酸鹽0.5%。A3B3C3與A3B3C2相比，持水力有顯著差異(P＜0.05)，鹽溶性蛋白含量和活性巰基含量差異不顯著(P＞0.05)。這可能是因?yàn)榛旌狭姿猁}的保水性能較好，混合磷酸鹽濃度的提高使得魷魚(yú)失水率下降，持水力增強(qiáng)。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of verification tests

2.2 復(fù)配保鮮劑對(duì)凍藏魷魚(yú)持水率的影響

持水率反映了肉制品的持水能力，持水率對(duì)肉制品的顏色、多汁性、柔嫩程度等食用品質(zhì)有直接影響［8-9］。魷魚(yú)的持水率越高，說(shuō)明持水能力越好，反之持水率越低，持水能力越差。Conalves等人［10］認(rèn)為冷凍過(guò)程中冰晶的形成，使肌肉組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，導(dǎo)致肉品持水性能下降。圖1是魷魚(yú)持水率隨凍藏時(shí)間的變化。從圖1可以看出，隨著凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，復(fù)配組和空白組的持水率都越來(lái)越低，表明魷魚(yú)的持水能力越來(lái)越差。復(fù)配組和空白組持水率相比差異極顯著(P＜0.01)，魷魚(yú)的 WHC初始值為(93.79±0.90)%，凍藏60 d后，復(fù)配組持水率為(87.76±0.72)%，空白組持水率僅為(77.04±0.87)%，WHC分別下降了6.03%和16.75%。三聚磷酸鈉與焦磷酸鹽可以與肌肉蛋白相互作用，促使肌動(dòng)球蛋白解離成肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白。Nakamura等人［11］認(rèn)為，肌動(dòng)球蛋白解離成肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白會(huì)導(dǎo)致WHC的提高。說(shuō)明復(fù)配組保鮮劑可以使凍藏魷魚(yú)保持好的持水能力。

圖1 魷魚(yú)凍藏中持水率的變化Fig.1 Change of water-holding rate from frozen squid

2.3 復(fù)配保鮮劑對(duì)凍藏魷魚(yú)鹽溶性蛋白含量的影響

蛋白質(zhì)是魷魚(yú)肌肉的主要成分，占到了胴體含量的16%～18%。按蛋白質(zhì)對(duì)溶劑的溶解性不同，可分為水溶性蛋白質(zhì)、鹽溶性蛋白質(zhì)、堿溶性蛋白質(zhì)、水不溶性蛋白質(zhì)。圖2表示了復(fù)配保鮮劑對(duì)凍藏魷魚(yú)鹽溶性蛋白含量的影響。

圖2 魷魚(yú)凍藏中鹽溶性蛋白含量的變化Fig.2 Change of salt soluble protein content from frozen squid

從圖2可以看出，隨著凍藏時(shí)間的增加，復(fù)配組和空白組的鹽溶性蛋白含量均呈下降趨勢(shì)。復(fù)配組與空白組鹽溶性蛋白含量差異極顯著(P＜0.01)。魷魚(yú)的鹽溶性蛋白質(zhì)含量初始值為(56.88±1.02)mg/g，凍藏60 d后，復(fù)配組SSP含量為(28.86±1.25)mg/g，空白組SSP含量為(14.96±1.16)mg/g。在整個(gè)凍藏過(guò)程中，復(fù)配組和空白組SSP含量分別下降了49.26%和73.70%。說(shuō)明復(fù)配組保鮮劑能夠減緩鹽溶性蛋白含量下降速率，有效防止蛋白質(zhì)冷凍變性。

鹽溶性蛋白也稱肌原纖維蛋白，包括肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白、肌鈣蛋白、輔肌動(dòng)蛋白等。一般認(rèn)為，凍藏過(guò)程中形成的二硫鍵、氫鍵和疏水鍵等導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的鹽溶性下降。曾名勇等［12-13］認(rèn)為，在凍藏過(guò)程中肌原纖維蛋白含量的下降是由于蛋白質(zhì)的部分結(jié)合水形成冰晶，導(dǎo)致肌動(dòng)球蛋白分子之間相互形成非共價(jià)鍵，進(jìn)而形成超大分子的不溶解的凝集體所致。另外，鹽溶性蛋白變性后，會(huì)產(chǎn)生一種在高離子強(qiáng)度下不能溶出但在堿液中可以溶出的蛋白質(zhì)，即堿溶性蛋白質(zhì)，也會(huì)導(dǎo)致鹽溶性含量在凍藏過(guò)程中下降。Sompongese等［14］認(rèn)為，巰基氧化形成的二硫鍵會(huì)導(dǎo)致肌球蛋白重鏈的聚合，降低其鹽溶性。

2.4 復(fù)配保鮮劑對(duì)凍藏魷魚(yú)活性巰基的影響

巰基含量反映了蛋白質(zhì)變性聚合的程度。圖3表示了復(fù)配保鮮劑對(duì)凍藏魷魚(yú)活性巰基含量的影響。

圖3 魷魚(yú)凍藏中活性巰基含量的變化Fig.3 Change of active sulfhydryl group content from frozen squid

Sompongse等［14］認(rèn)為，巰基含量在凍藏過(guò)程中下降的原因可能是冰晶的形成使得肌原纖維蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使埋藏在分子內(nèi)部的巰基暴露出來(lái)，進(jìn)而被氧化成二硫鍵，導(dǎo)致巰基含量的減少。從圖3可以看出，隨著凍藏時(shí)間的增加，復(fù)配組和空白組的活性巰基含量都呈下降的趨勢(shì)。與空白組相比，復(fù)配組活性巰基含量有顯著差異(P＜0.05)。初始點(diǎn)的魷魚(yú)活性巰基含量為(7.12±0.03)×10-5mol/g，凍藏至60 d時(shí)，復(fù)配組活性巰基含量下降至(5.16±0.04)×10-5mol/g，空白組活性巰基含量為(3.15±0.05)×10-5mol/g。在整個(gè)凍藏過(guò)程中，復(fù)配組的活性巰基含量下降了1.96×10-5mol/g，空白組下降了3.97×10-5mol/g，空白組的活性巰基含量減少值是復(fù)配組活性巰基含量減少值的2倍。上述結(jié)果表明，復(fù)配組保鮮劑能夠很大程度的抑制巰基的氧化，提高抗氧化性和凍藏穩(wěn)定性，保持凍藏魷魚(yú)的品質(zhì)。

2.5 復(fù)配保鮮劑對(duì)凍藏魷魚(yú)色澤的影響

表5是凍藏魷魚(yú)復(fù)配組和空白組的L*，a*，b*值。復(fù)配組和空白組L*值相關(guān)系數(shù)為0.903，相關(guān)性大，a*值，b*值相關(guān)系數(shù)很小。解凍后的魷魚(yú)顏色略發(fā)白，顏色較為一致，故選定L*值來(lái)進(jìn)行其色澤的評(píng)價(jià)。從表5可以看出，隨著凍藏時(shí)間的增加，復(fù)配組和空白組的L*值都緩慢下降，復(fù)配組和空白組L*值差異極顯著(P＜0.01)。Park等和 Yang等［15-16］認(rèn)為L(zhǎng)*值容易受到含水量的影響，含水量越大，L*值越大。Conalves等人［10］認(rèn)為含水量高的肉品表面游離水分增加，對(duì)光的反射效果增強(qiáng)，從而造成L*值的升高。復(fù)配組持水力高，水分含量高，所以L*值大。復(fù)配組L*值較大，肉更加有光澤，說(shuō)明復(fù)配保鮮劑有助于保持凍藏魷魚(yú)肉品的光澤度。

表5 復(fù)配保鮮劑對(duì)凍藏魷魚(yú)色澤的影響Table 5 Effect of complexantistaling agents on color of frozen squid

2.6 復(fù)配保鮮劑對(duì)凍藏魷魚(yú)質(zhì)構(gòu)的影響

本研究采用TPA方法對(duì)魷魚(yú)肌肉組織的硬度(最大剪切力)特性進(jìn)行分析。圖4表示了復(fù)配保鮮劑對(duì)魷魚(yú)最大剪切力的影響。

圖4 魷魚(yú)凍藏中最大剪切力的變化Fig.4 Change of maximum shear stress from frozen squid

如圖4所示，復(fù)配組和空白組的最大剪切力都隨凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，復(fù)配組的下降速度低于空白組，復(fù)配組和空白組差異顯著(P＜0.05)。影響剪切力的因素有很多，pH、脂質(zhì)氧化、酶水解、預(yù)處理方式、甲醛的形成、碳酸鹽、冷凍保護(hù)劑等都會(huì)對(duì)剪切力產(chǎn)生影響［17］。復(fù)配保鮮劑對(duì)于減緩魷魚(yú)質(zhì)構(gòu)變化有一定的作用，但其對(duì)魷魚(yú)咀嚼性和彈性方面的影響仍需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

(1)本文選取保鮮效果較好的海藻糖、乳酸鈉和混合磷酸鹽進(jìn)行復(fù)配，通過(guò)3因素3水平的L9(34)的正交試驗(yàn)，以持水率、鹽溶性蛋白質(zhì)含量、活性巰基含量為指標(biāo)，用綜合評(píng)分法分析了魷魚(yú)在-20℃凍藏條件下的品質(zhì)變化。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析，各因素對(duì)凍藏魷魚(yú)保鮮效果影響的主次順序?yàn)楹Ｔ逄牵救樗徕c＞混合磷酸鹽。海藻糖和乳酸鈉的添加量對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果有極顯著的影響(P＜0.01)，混合磷酸鹽添加量對(duì)試驗(yàn)有顯著影響(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)得出的復(fù)配保鮮劑的最佳配比濃度是海藻糖5%，乳酸鈉6%，混合磷酸鹽0.5%。

(2)在-20℃凍藏60 d后，復(fù)配組和空白組的WHC、SSP、活性巰基含量分別為87.76%、77.04%;28.86、14.96 mg/g;5.16 × 10-5、3.15 × 10-5mol/g。復(fù)配組和空白組WHC和SSP含量呈極顯著差異(P＜0.01)，活性巰基含量差異顯著(P＜0.05)。通過(guò)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)復(fù)配保鮮劑對(duì)于提高凍藏魷魚(yú)的持水率，減緩鹽溶性蛋白含量和活性巰基含量的下降速率有顯著的作用。同時(shí)復(fù)配保鮮劑有助于保持凍藏魷魚(yú)肉品的光澤度，減緩魷魚(yú)質(zhì)構(gòu)變化。說(shuō)明該復(fù)配保鮮劑對(duì)-20℃貯藏條件下的魷魚(yú)保鮮效果顯著。

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