葉展，冉玉兵，胡傳榮，2，何東平，2，劉零怡，2，亞森·玉山，羅質(zhì)，2

1(武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢，430023)2(國(guó)家糧食局糧油資源綜合開發(fā)工程技術(shù)研究中心，湖北武漢，430023)

3(湖北奧星糧油工業(yè)有限公司，湖北 襄陽，441800)

目前，油脂脫膠較多采用傳統(tǒng)脫膠方法，如水化脫膠、酸法脫膠、超級(jí)脫膠、聯(lián)合脫膠等，傳統(tǒng)脫膠方法可以有效地除去水化磷脂，但很難除去非水化磷脂，但很難除去非水化磷脂［1-2］。酶法脫膠通過添加磷脂酶，使非水化磷脂水解成溶血性磷脂，溶血性磷脂具有良好的親水性，可以利用水化方法去除［3］。

酶法脫膠是一種經(jīng)濟(jì)環(huán)保的油脂精煉方法，磷脂酶根據(jù)其作用于磷脂的位點(diǎn)不同分為磷脂酶A1(PLA1)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)和磷脂酶D(PLD)4種，除了磷脂酶D由于酶源比較狹窄、含量低、提純困難，目前研究較少之外，前三者已有大量研究［4］，但是磷脂酶C脫膠水解產(chǎn)物為甘油二酯及有機(jī)磷酸酯(磷酸膽堿、磷酸乙醇胺或磷酸肌醇等)，脫膠過程不會(huì)產(chǎn)生其他副產(chǎn)品，安全性顯得更高，并且脫膠過程中只需1% ～2%的水分，可避免大量廢水的產(chǎn)生，降低了對(duì)環(huán)境的壓力［5］，近幾年更是得到廣泛關(guān)注和研究。

本文研究了磷脂酶C對(duì)菜籽毛油的脫膠工藝，并對(duì)工藝進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化，同時(shí)對(duì)毛油與酶法脫膠油二者甘油酯組成的差異，水化脫膠、酶法脫膠后的磷脂進(jìn)行了對(duì)比分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菜籽毛油(磷含量為693 mg/kg)，湖北奧星糧油工業(yè)有限公司提供;磷脂酶C，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生產(chǎn)提供(實(shí)測(cè)酶活9 000 U/g)，雙蒸水稀釋1 000倍冷藏備用;檸檬酸、NaOH等為分析純?cè)噭瑖?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

棒狀薄層色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器(TLCFID)，日本島津公司;Rancimat743型油脂氧化穩(wěn)定性分析儀，瑞士萬通公司;DF-101S型集熱式恒溫磁力攪拌器，鞏義市英峪予華儀器廠;XHF-D高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司;SHA-CA數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，江蘇東鵬儀器制造有限公司;TD5A臺(tái)式離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司;SRJX-4-13電阻爐，北京市永光明醫(yī)療儀器廠;UV-1600型紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司;PHS-3C型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基本指標(biāo)測(cè)定方法

PLC活力測(cè)定。采用 NPPC法［6］(p-nitrophenylphorylchoine，NPPC，對(duì)硝基苯磷酸膽堿)。以NPPC作為PLC作用底物，水解產(chǎn)物一對(duì)硝基苯酚是一種黃色物質(zhì)，在410 nm處有最大吸收。在pH 7.2、37℃條件下，每分鐘催化l nmol NPPC水解的酶量定義為一個(gè)酶活單位［7］。

磷含量的測(cè)定:參照GB/T 5537-2008。

1.2.2 菜籽油磷脂酶C脫膠工藝

取60 g過濾菜籽毛油水浴至70℃，添加油重1.2%質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%檸檬酸溶液，15 000 r/min均質(zhì)3 min，45℃水浴恒溫振蕩滯留反應(yīng)30 min(速率200 r/min)，結(jié)束后加稀釋酶液 12 mL/kg，15 000 r/min均質(zhì)3 min，加水40 mL/kg(溫度比油溫稍高)，45℃水浴恒溫振蕩(速率200 r/min)，進(jìn)行酶法脫膠反應(yīng)90 min，反應(yīng)結(jié)束，取出90℃水浴加熱滅酶，離心機(jī)分離膠質(zhì)和油(轉(zhuǎn)速4 500 r/min，離心時(shí)間10 min)，油樣進(jìn)行真空干燥(干燥條件:溫度140℃，壓力≤4.0 kPa，時(shí)間30 min)后即為PLC脫膠油。

1.2.3 菜籽油PLC脫膠單因素試驗(yàn)

取菜籽毛油，采用1.2.2所述脫膠工藝，進(jìn)行菜籽油酶法脫膠，分別研究檸檬酸溶液用量(0.6、2.4、4.2、6.0、7.8、9.6 mL/kg)、加酶量(4.0、8.0、12.0、16.0、20.0、24.0 mL/kg)、加水量(20、30、40、50、60、70 mL/kg)、反應(yīng)溫度(25、35、45、55、65、75 ℃)和反應(yīng)時(shí)間(30、60、90、120、150、180 min)這 5 個(gè)因素對(duì)菜籽油磷脂酶C脫膠效果的影響。

1.2.4 PLC脫膠工藝條件的優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design Expert 8.0.5軟件中心組合設(shè)計(jì)(central composite design，CCD)模塊中的二次回歸正交中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)了一組3因素5水平共計(jì)23次的試驗(yàn)(Full CCD設(shè)計(jì))，其中析因部分試驗(yàn)次數(shù)為14次，星點(diǎn)數(shù)為5次，為了保證均一精密性并且減小試驗(yàn)誤差，將中心重復(fù)數(shù)手動(dòng)調(diào)整為9次，共計(jì)23個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，來確定PLC脫膠工藝最優(yōu)條件組合［8］。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及水平見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Code factors and levels of the CCD experiment design

1.2.5 菜籽油磷脂酶C脫膠效果分析

甘油酯含量分析。實(shí)驗(yàn)采用棒狀薄層色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器(TLC-FID)定量檢測(cè)菜籽毛油和磷脂酶C脫膠油中甘油酯的含量。取1滴油樣于小試管中，將樣品用1 mL的正己烷溶解，取1 μL樣品點(diǎn)于薄層色譜棒上，在正己烷/無水乙醚/冰乙酸(體積比55∶15∶1)溶劑體系中展開，然后放入FID裝置中進(jìn)行分析。TLC-FID分析條件:氫氣流速:90 mL/min;空氣流速:2.0 L/min;掃描速度:30s/棒。

溶血性磷脂含量分析。水化脫膠、酶法脫膠后的磷脂先用丙酮進(jìn)行純化處理，實(shí)驗(yàn)采用棒狀薄層色譜—?dú)浠鹧骐x子化檢測(cè)器(TLC-FID)定量檢測(cè)溶血磷脂的含量。取0.30 g純化樣品于小試管中，將樣品用1 mL的正己烷溶解，取1 μL樣品點(diǎn)于薄層色譜棒上，在三氯甲烷/甲醇/水(體積比65∶35∶5)溶劑體系中展開，然后放入FID裝置中進(jìn)行分析，分析條件同1.2.5.1。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel繪制試驗(yàn)表格;采用Origin 8.5繪制單因素試驗(yàn)曲線圖和條形圖;采用 Design Expert 8.0.5繪制響應(yīng)面等高線圖，并進(jìn)行方差分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 菜籽油PLC脫膠單因素試驗(yàn)

2.1.1 檸檬酸添加量對(duì)脫膠效果的影響

檸檬酸溶液添加量對(duì)菜籽油磷脂酶C脫膠效果的影響，如圖1所示。檸檬酸溶液添加量在0.6～9.6 mL/kg內(nèi)變化時(shí)，PLC脫膠油磷含量先降低后升高，在檸檬酸溶液加入量為6.0 mL/kg時(shí)，脫膠油磷含量最低。對(duì)油水混合物的pH進(jìn)行測(cè)定，pH值為4.57，表明磷脂酶C最適 pH 值為4.57，楊嬌［9］的研究表明，磷脂酶C適宜于偏酸性環(huán)境，磷脂酶C催化的脫膠反應(yīng)體系的pH值應(yīng)設(shè)定在4.5～5.2，pH值過高或者過低，都會(huì)導(dǎo)致磷脂酶的部分或全部活性喪失。因此，為了進(jìn)一步確定最適酶反應(yīng)條件，檸檬酸溶液加入量宜在4.2～7.8 mL/kg內(nèi)作進(jìn)一步優(yōu)化。

圖1 檸檬酸添加量對(duì)PLC脫膠油磷含量的影響Fig.1 Effect of citric acid dosage on the phosphorus content of PLC degumming rapeseed oil

2.1.2 加酶量對(duì)脫膠效果的影響

加酶量對(duì)菜籽油磷脂酶C脫膠效果的影響，如圖2所示。由圖2可知，隨著稀釋酶液的不斷增加，脫膠油中磷含量急劇下降，磷脂酶液加入量超過12 mL/kg后，脫膠油磷含量降低緩慢，下降趨勢(shì)相對(duì)平緩?？紤]到磷脂酶C的生產(chǎn)成本較高，結(jié)合實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況，磷脂酶C稀釋酶液加入量需要在12 mL/kg左右進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)優(yōu)化，以確定適宜用量。

圖2 加酶量對(duì)PLC脫膠油磷含量的影響Fig.2 Effect of PLC dosage on the phosphorus content of PLC degumming rapeseed oil

2.1.3 加水量對(duì)脫膠效果的影響

加水量對(duì)菜籽油磷脂酶C脫膠效果的影響，如圖3所示。由圖3可知，隨著加水量的增加，脫膠油磷含量先降低，后增加，在加水量為40 mL/kg時(shí)，脫膠油磷含量最低，達(dá)到21.90 mg/kg。研究表明，酶法脫膠中，水的加入量過少，不利于磷脂微粒的絮凝，而加水量過多，會(huì)加劇油脂的乳化現(xiàn)象，以致后續(xù)的離心分離困難［10］，而且會(huì)產(chǎn)生更多的廢水，污染環(huán)境，這與油脂的適度加工相背。因此，本研究中，確定酶法脫膠用水量為40 mL/kg。

圖3 加水量對(duì)PLC脫膠油磷含量的影響Fig.3 Effect of amount of water addition on the phosphorus content of PLC degumming rapeseed oil

2.1.4 反應(yīng)溫度對(duì)脫膠效果的影響

反應(yīng)溫度對(duì)菜籽油磷脂酶C脫膠效果的影響，如圖4所示。在25～75℃內(nèi)，脫膠油磷含量隨著溫度的升高先降低后升高，在45℃時(shí)，磷含量最低，脫膠效果較好，說明磷脂酶C最適溫度為45℃左右。實(shí)際上，磷脂酶C對(duì)溫度敏感，溫度較低時(shí)，其活性被抑制，催化功能降低，而溫度較高超過最適溫度時(shí)，酶的穩(wěn)定性大大降低，半衰期縮短［11］，也導(dǎo)致其活性喪失，只有在最適溫度下，才能發(fā)揮出高能催化作用。因此，對(duì)脫膠溫度在45℃左右進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，以找出最適溫度。

圖4 脫膠溫度對(duì)PLC脫膠油磷含量的影響Fig.4 Effect of degumming temperature on the phosphorus content of PLC degumming rapeseed oil

2.1.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)脫膠效果的影響

反應(yīng)時(shí)間對(duì)菜籽油磷脂酶C脫膠效果的影響，如圖5所示。由圖5可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，脫膠油中磷含量先急劇下降，脫膠時(shí)間大于90 min后，脫膠油磷含量雖然降低，但降低幅度較小，趨于平緩，而且150 min以后脫膠油磷含量基本穩(wěn)定不變，這是由于PLC可以催化磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和磷酯酰絲氨酸變?yōu)樗字?，但是其不能催化磷脂酰肌醇或磷脂酸反?yīng)［10，12］。因此考慮到精煉效率和成本，并結(jié)合是實(shí)際情況，脫膠時(shí)間確定為90 min較合理。

圖5 脫膠時(shí)間對(duì)PLC菜籽脫膠油磷含量的影響Fig.5 Effect of degumming time on the phosphorus content of PLC degumming rapeseed oil

2.2 菜籽油PLC脫膠工藝優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取檸檬酸加入量、磷脂酶C加入量和脫膠溫度，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，按照1.2.4中響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

得到二次回歸模型為:

Y=124.482 9-8.242 4A-11.652 0B-0.925 1C+0.086 9AB+0.057AC+0.015 9BC+0.596 0A2+0.416 7B2+0.008 2C2，方差分析見表3，由表3可知，該模型顯著(P＜0.000 1)，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.077 3＞0.05)，且說明在預(yù)測(cè)磷脂酶C脫膠油磷含量方程的總的變異中，有98.99%是由獨(dú)立變量引起的，由此可知，該回歸模型包含了影響脫膠油磷含量的主要因素，可信度高，模型能較好的預(yù)測(cè)和分析磷脂酶C脫膠油中的磷含量。檸檬酸添加量、加酶量和酶解溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響非常顯著，交互作用中，檸檬酸添加量和加酶量交互作用(如圖6所示)、加酶量和酶解溫度交互作用(如圖7所示)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響顯著。根據(jù)F值可知，各因素對(duì)脫膠效果影響大小的次序?yàn)?加酶量＞酶解溫度＞檸檬酸添加量，這與單因素試驗(yàn)結(jié)果也基本吻合。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Results of CCD experiment

表3 二次回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for the response surface quadratic regression model

圖6 檸檬酸添加量和加酶量交互作用等高線圖Fig.6 Contour plots of the interaction effects of citric acid solution dosage and enzyme dosage

圖7 加酶量和酶解溫度交互作用等高線圖Fig.7 Contour plots of the interaction effects of enzyme dosage and enzymatic hydrolysis temperature

在Design-Expert 8.0.5軟件優(yōu)化模塊中，將優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置成為最小值，預(yù)測(cè)最佳脫膠條件為:檸檬酸添加量5.80 mL/kg，加酶量12.57 mL/kg，酶解溫度42.20℃，脫膠油磷含量為7.83 mg/kg。為了方便實(shí)際操作，將最優(yōu)工藝條件修正為檸檬酸添加量5.80 mL/kg，加酶量12.60 mL/kg，酶解溫度42.20℃，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，在該條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值為7.85 mg/kg，這與所預(yù)測(cè)的最優(yōu)值基本吻合，這也進(jìn)一步表明了回歸模型的有效性［13］。

2.3 菜籽油磷脂酶C脫膠效果分析

2.3.1 甘油酯含量分析

在最優(yōu)工藝條件下，對(duì)菜籽毛油進(jìn)行酶法脫膠，采用1.2.5.1所述方法對(duì)菜籽毛油和磷脂酶C脫膠油中甘油酯含量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖8所示。

圖8 菜籽毛油和磷脂酶C脫膠菜籽油甘油酯和游離脂肪酸含量Fig.8 Glyceride content and FFA content of crude rapeseed oil and degummed oil

由圖8可知，菜籽毛油經(jīng)磷脂酶C脫膠后，甘一酯和游離脂肪酸含量基本無變化，甘二酯含量從約2.5%增加到約6.5%，而甘三酯含量從約93%下降到約89%，這一變化主要原因在于磷脂酶C脫膠油中甘二酯含量的增加。磷脂酶C作用位點(diǎn)如圖9所示，磷脂酶C作用位點(diǎn)在磷脂分子的Sn-3位，實(shí)際上，磷脂經(jīng)磷脂酶C水解后，產(chǎn)生甘油二酯(DAG)和磷酸化合物，甘油二酯作為油脂成分能夠保留在中性油中，因此，使用PLC脫膠能提高成品油得率，另一方面，水解產(chǎn)生的水溶性磷酸化合物，不具有乳化性從而減少了離心過程中因膠質(zhì)夾帶中性油而造成的損失，降低了中性油損耗［5，14］。

圖9 磷脂酶C在磷脂分子中的作用位點(diǎn)注:X表示膽堿、乙醇胺、肌醇和氫等Fig.9 The action site of phospholipase C on Phospholipid molecule

2.3.2 溶血性磷脂含量分析

采用1.2.5.2所述方法分別對(duì)水化脫膠磷脂和磷脂酶C脫膠磷脂組成成分進(jìn)行分析，根據(jù)溶血磷脂標(biāo)樣進(jìn)行定性，峰面積歸一化法定量，結(jié)果如圖10所示。

由圖10可知，水化脫膠磷脂與酶法脫膠磷脂相比，酶法脫膠磷脂中溶血磷脂含量比水化脫膠磷脂中的高出約50%，酶法脫膠的酶解率顯著升高，該結(jié)果這表明，磷脂酶C能夠使得菜籽油中的其他磷脂轉(zhuǎn)化為溶血磷脂，而溶血磷脂為水化磷脂，易除去。也說明磷脂酶C脫膠不但使菜籽油磷含量顯著降低，而且可提高油腳中價(jià)值更高的溶血磷脂含量，提高經(jīng)濟(jì)效益［15］。

圖10 水化脫膠油和磷脂酶C脫膠油油腳磷脂組成Fig.10 The composition of phospholipid in water degumming and PLC degumming residue

3 結(jié)論

(1)在單因素基礎(chǔ)上，經(jīng)過響應(yīng)面法對(duì)PLC脫膠主要工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，得到菜籽油磷脂酶C脫膠最佳工藝參數(shù)為檸檬酸添加量5.80 mL/kg，加酶量12.60 mL/kg，酶解溫度42.20℃，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，得磷脂酶C脫膠油磷含量為7.85 mg/kg。

(2)運(yùn)用棒狀薄層色譜—?dú)浠鹧骐x子化檢測(cè)器分別對(duì)甘油酯含量和磷脂進(jìn)行分析，進(jìn)而探討菜籽油磷脂酶C脫膠的效果，結(jié)果顯示菜籽毛油經(jīng)磷脂酶C脫膠后，甘一酯和游離脂肪酸含量基本無變化，甘二酯含量有一定增加，甘三酯含量有少量減少，中性油得率有所提高;同時(shí)，磷脂酶C脫膠磷脂中溶血磷脂含量遠(yuǎn)高于水化脫膠磷脂中的溶血磷脂含量，這進(jìn)一步表明磷脂酶C脫膠法在油脂得率和脫膠效果等方面要明顯優(yōu)于水化脫膠法。

(3)磷脂酶C脫膠對(duì)油脂品質(zhì)的影響雖有相關(guān)研究，但仍有所局限，因此，對(duì)于磷脂酶C是否能使后續(xù)精煉難度降低，并且提高成品油品質(zhì)，需要做深入探討;除此之外，酶法脫膠還受到其他因素的影響，如金屬離子(Ca2+，Mg2+等)種類和含量、磷脂酶添加速率等，這些因素在后續(xù)的研究中也需進(jìn)行深入研究。

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