陳小輝，胡 樂(lè)，柯志勇，楊翠蘭，馬 寧(南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，廣州 510515;通訊作者，E-mail:276072029@qq．com)

教學(xué)與科研中常用于顯示細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA的染色方式為甲基綠－派洛寧染色法［1］。本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的《細(xì)胞中DNA和RNA的染色觀察》實(shí)驗(yàn)通常開(kāi)展“洋蔥內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA的分布”。在本科教學(xué)中，我們發(fā)現(xiàn)此染色法的效果與實(shí)際效果相差較大，同時(shí)甲基綠與派洛寧的濃度比為5∶2時(shí)，染色過(guò)程中沒(méi)有對(duì)洋蔥內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行固定，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)常出現(xiàn)細(xì)胞核呈現(xiàn)紫紅色而非藍(lán)綠色，洋蔥內(nèi)皮細(xì)胞容易出現(xiàn)質(zhì)壁分離，相鄰細(xì)胞出現(xiàn)很大染色差異等現(xiàn)象。本研究主要通過(guò)探索甲基綠與派洛寧的合適濃度配比，同時(shí)尋找合適的固定液，從而獲得更好的實(shí)驗(yàn)效果。

1 材料與方法

1．1 材料

新鮮洋蔥。試劑:甲基綠、派洛寧Y(購(gòu)自廣州威佳科技有限公司)，無(wú)水乙醇、甲醇、冰醋酸、醋酸鈉(購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)試劑中心)。

1．2 試劑配制

醋酸鹽緩沖溶液(pH 4．8):冰醋酸 2．4 ml，醋酸鈉8．16 g，蒸餾水498 ml混合后配制成0．2 mol/L的醋酸鹽緩沖溶液［2］。

甲基綠派洛寧混合染色液的配制:甲基綠粉末8 g，溶于醋酸鹽緩沖溶液400 ml，配制成2%甲基綠染色液。派洛寧粉末8 g，溶于醋酸鹽緩沖溶液400 ml，配制成2%派洛寧染色液。配制2%甲基綠溶液2%派洛寧溶液的體積比為 5∶2、2∶1、3∶2 和 1∶1 的混合染液。

甲醇冰醋酸固定液:甲醇300 ml，冰醋酸100 ml混勻后配制成固定液［3］。

1．3 實(shí)驗(yàn)步驟

①取材:用鑷子取新鮮洋蔥的內(nèi)表皮約0．5 cm2，置于載玻片上，分為 5∶2，2∶1，3∶2 和 1∶1 四個(gè)濃度組。②固定:滴1－2滴甲醇冰醋酸固定液于洋蔥標(biāo)本上，固定5 min。③染色:吸干多余的固定液，各組對(duì)應(yīng)滴加兩滴各自濃度的甲基綠派洛寧混合染色液。染色5 min。④沖洗:在自來(lái)水下用緩慢的流水沖洗，充分洗去浮色，直至所流下來(lái)的水為無(wú)色。⑤蓋片觀察:用吸水紙吸干水分，蓋上蓋玻片，置于鏡下觀察。改進(jìn)前后實(shí)驗(yàn)步驟詳見(jiàn)表1。

表1 改進(jìn)前后洋蔥內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA染色法的實(shí)驗(yàn)步驟Table 1 The experimental steps of DNA and RNA staining in onion epidermal cells before and after improvement

2 結(jié)果

改進(jìn)前未固定而染色的細(xì)胞絕大部分發(fā)生嚴(yán)重質(zhì)壁分離，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)多數(shù)細(xì)胞著色深淺不一，部分細(xì)胞質(zhì)也呈現(xiàn)藍(lán)綠色。固定后染色的細(xì)胞著色良好，極少發(fā)生質(zhì)壁分離，染色時(shí)間短。四個(gè)濃度中3∶2和1∶1的洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞的著色情況較好，細(xì)胞質(zhì)被派洛寧染成紅色較明顯，并且能清楚觀察到紅色的核仁，細(xì)胞核被甲基綠染成藍(lán)綠色。濃度為5∶2和2∶1的細(xì)胞經(jīng)過(guò)染色后細(xì)胞質(zhì)也被染成紅紫色，與細(xì)胞核對(duì)比不明顯，也不能清楚觀測(cè)到核仁。染色結(jié)果詳見(jiàn)圖1。

圖1 不同條件下洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞染色觀察Figure 1 Observation on dyeing of onion epidermal cells under different conditions

3 討論

由于甲基綠－派洛寧染色法一般用于定性分析，所以它的染色過(guò)程并未統(tǒng)一，不同研究人員使用的條件也不一樣。文獻(xiàn)中曾出現(xiàn)多種染色方法，有學(xué)者在染色之前通過(guò)8%HCL溶液中解離洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞，可以達(dá)到較好的染色效果［4］，但是鹽酸沖洗不凈會(huì)影響pH值，對(duì)后續(xù)染色產(chǎn)生不利影響，以及烘干、水解操作中存在安全隱患［5］，不適用于教學(xué)。

本研究對(duì)細(xì)胞中DNA和RNA染色方法的改進(jìn)是增加了對(duì)洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞的固定。甲醇冰醋酸固定液是細(xì)胞培養(yǎng)教學(xué)中最常用的染色固定液，通過(guò)固定能使細(xì)胞失活，能夠防止質(zhì)壁分離，并且使其通透性增強(qiáng)，減少染色時(shí)間，能達(dá)到較好的染色效果;其次因其能迅速揮發(fā)，固定后無(wú)需漂洗，從而節(jié)省時(shí)間。

本實(shí)驗(yàn)在操作時(shí)采用過(guò)兩種品牌的甲基綠、派洛寧Y染液，在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，兩種染色液在濃度配制時(shí)分別表現(xiàn)出不同的最適宜濃度，但均位于3∶2至1∶1之間。原因可能是不同公司提供的甲基綠、派洛寧Y試劑純度不盡相同，實(shí)驗(yàn)教學(xué)前需要任課老師做預(yù)實(shí)驗(yàn)，找到合適的配制比例。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)注意以下幾方面:①取材時(shí)注意區(qū)分洋蔥內(nèi)表皮的光滑面和葉肉面，將取好的洋蔥內(nèi)表皮葉肉面向下平鋪于載玻片上。②固定液從洋蔥內(nèi)表皮邊緣處滴加，用鑷子輕輕移動(dòng)洋蔥內(nèi)表皮，通過(guò)虹吸，使洋蔥內(nèi)表皮的葉肉面充分接觸固定液，固定5 min后可用鑷子將洋蔥內(nèi)表皮輕輕夾起來(lái)，自然風(fēng)干。③染色液從洋蔥內(nèi)表皮邊緣處滴加，用鑷子輕輕移動(dòng)洋蔥內(nèi)表皮，使洋蔥內(nèi)表皮漂浮在染色液上，洋蔥內(nèi)表皮的葉肉面充分接觸染色液，染色過(guò)程中用鑷子輕輕移動(dòng)洋蔥內(nèi)表皮，使其染色充分。

［1］胡敏，肖純．顯示細(xì)胞DNA和RNA的甲基綠－派洛寧技術(shù)的改進(jìn)［J］．江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，17(1):66－67．

［2］羅深秋，劉建中．醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)及復(fù)習(xí)思考題［M］．北京:科學(xué)出版社，2012:19－21．

［3］程寶鸞．動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)［M］．廣州:中山大學(xué)出版社，2009:122．

［4］ 何嬌．DNA和RNA在細(xì)胞中的分布情況觀察［J］．熱帶農(nóng)業(yè)工程，2012，36(1):8－12．

［5］孟希．觀察DNA和RNA在細(xì)胞中分布實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化［J］．生物學(xué)教學(xué)，2013，38(5):62．