結(jié)直腸中組蛋白去乙?；傅谋磉_(dá)及意義

謝權(quán)彭勃張罡哪仁

(?？谑腥嗣襻t(yī)院中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院胃腸外科病理科,海南?？?70208)

摘要〔〕目的探討組蛋白去乙酰化酶(HDAC1)在結(jié)直腸癌中的表達(dá)并分析其臨床意義。方法免疫組織化學(xué)法檢測(cè)89例結(jié)直腸癌組織、89例癌旁組織、32例正常結(jié)/直腸組織和21例腺瘤組織中HDAC1表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析HDAC1染色強(qiáng)度與臨床病理特征關(guān)系。結(jié)果癌組織、癌旁組織、腺瘤組織和正常結(jié)/直腸組織中HDAC1表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性率分別為73.0%(65/89)、56.2%(50/89)、66.7%(14/21)和40.6%(13/32)；HDAC1表達(dá)與患者Dukes分期、組織學(xué)分型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與患者性別、年齡及腫瘤的大小無(wú)關(guān)。Dukes A～B分期HDAC1強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于Dukes C～D分期(χ2=5.939,P=0.031)。低、未分化組HDAC1強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于高、中分化腺癌(χ2=18.692,P=0.036)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者HDAC1強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(χ2=21.025,P=0.030)。結(jié)論HDAC1高表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理學(xué)特征相關(guān)。免疫組化方法檢測(cè)HDAC1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)，有可能成為預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者對(duì)HDAC抑制劑治療反應(yīng)的新手段。

關(guān)鍵詞〔〕結(jié)直腸癌；組蛋白去乙酰化酶；免疫組織化學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R735.3〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

第一作者：謝權(quán)(1956-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事結(jié)直腸外科基礎(chǔ)與臨床研究。

研究〔1〕認(rèn)為多數(shù)腫瘤對(duì)組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑(HDACi )敏感。HDACi被用于各種腫瘤的臨床試驗(yàn)，而基于淋巴瘤的研究認(rèn)為HDAC1蛋白表達(dá)可能是腫瘤對(duì)HDACi敏感的重要因素〔2〕。HDAC1特異干擾RNA能有效誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡和細(xì)胞周期阻滯，從而抑制細(xì)胞的增殖〔3〕。HDAC1是否與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討結(jié)直腸中HDAC1的表達(dá)及臨床意義。

1材料與方法

1.1對(duì)象隨機(jī)選取2009～2011年?？谑腥嗣襻t(yī)院胃腸外科行結(jié)直腸癌根治手術(shù)切除的癌組織標(biāo)本89例、癌旁組織(癌組織邊緣4 cm)標(biāo)本89例、正常結(jié)/直腸組織標(biāo)本32例和腺瘤組織標(biāo)本21例。89例癌組織標(biāo)本中，男58例，女31例，平均年齡(51±12.5)歲。依據(jù)2006年世界衛(wèi)生組織(WHO)分類(lèi)法進(jìn)行臨床病理特征分類(lèi)。Dukes分期：A期15例、B期24例、C期40例、D期10例。組織學(xué)分型：高分化腺癌12例、中分化腺癌40例、低分化癌26、未分化腺癌11例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者35例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者54例。所有患者在行手術(shù)前均未進(jìn)行過(guò)放、化療。所選標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。

1.2方法及試劑免疫組化采用鏈霉菌蛋白-過(guò)氧化物復(fù)合物(SP)法，染色步驟按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。HDAC1多克隆抗體為上海吉泰生物科技有限公司產(chǎn)品；二抗、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒為福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.3結(jié)果判定HDAC1陽(yáng)性染色為位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的棕黃色顆粒。采用雙盲法隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(400 倍)，每個(gè)高倍視野下計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞。觀察陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)及染色強(qiáng)度。對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)計(jì)分(< 5%=0，5%～25%=1，26%～50%=2，51%～75%=3，>75=4)及染色強(qiáng)度(無(wú)色=0，淡黃色=1，棕黃色=2，深棕色=3)進(jìn)行評(píng)分，累積0分為(-)，1～2分為(+)，3～4分為()，5～7分為()。將“-～+”定義為蛋白低表達(dá)，“～”定義為蛋白高表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS15.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1HDAC1在不同組織中的表達(dá)在不同結(jié)直腸組織中，HDAC1主要表達(dá)于胞核。癌組織中HDAC1高表達(dá)率，與癌旁組織中比較差異顯著(P<0.05)；腺瘤組織與正常組織比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；同時(shí)，正常組織與癌組織兩者比較差異顯著(χ2=0.842,P<0.05)。見(jiàn)圖1，表1。

圖1　HDAC1在結(jié)腸癌組織細(xì)胞中的表達(dá)(×200)

2.2HDAC1表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系HDAC1表達(dá)與患者性別、年齡及腫瘤的大小無(wú)關(guān)。見(jiàn)表2。

2.3HDAC1表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系在結(jié)直腸癌Dukes分期中Dukes A、B、C、D期HDAC1高表達(dá)率呈隨級(jí)增加趨勢(shì)；A～B期HDAC1高表達(dá)率顯著低于C～D期(P<0.05)。在結(jié)直腸癌組織學(xué)分型中高、中、低、未分化腺癌隨著組織學(xué)分型級(jí)別降低HDAC1強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率增高；低、未分化組HDAC1高表達(dá)率顯著高于高、中分化腺癌(P<0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌HDAC1高表達(dá)率(30/35)顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表1　HDAC1在不同組織中的表達(dá)

表2　HDAC1表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系

表3　HDAC1蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

3討論

HDAC1是1996年由美國(guó)哈佛大學(xué)Taunton實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)哺乳動(dòng)物的HDAC，基因全長(zhǎng)約41 kb，蛋白由482個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量約55 kD〔4〕。HDAC1與HDAC2、HDAC3和HDAC8共屬于I類(lèi)組蛋白去乙?；?。該類(lèi)酶與酵母轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子RPD3和多核配合物亞基具有高度同源性，在亞細(xì)胞定位、多亞基復(fù)合物的聯(lián)系及蛋白翻譯后修飾(PTMs)中具有重要作用。目前已證實(shí)，HDAC1通過(guò)調(diào)節(jié)組蛋白和非組蛋白的蛋白質(zhì)去乙?；瘏⑴c細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡調(diào)控，可能是哺乳動(dòng)物基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子〔5〕。HDAC1可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑p21表達(dá)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞周期的調(diào)控，例如宮頸癌Hela細(xì)胞〔6〕。HDAC1基因敲除小鼠，胚胎細(xì)胞增殖能力比對(duì)照明顯減弱〔7〕。HDAC1的表達(dá)可能與多種腫瘤如胃癌、乳腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌等的進(jìn)展有關(guān)。HDAC1高表達(dá)明顯增加腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，且其表達(dá)水平受調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、分化和增殖的轉(zhuǎn)錄因子和高細(xì)胞密度的影響〔5〕。該基因的失活也影響細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。在多數(shù)人腫瘤細(xì)胞株的研究中發(fā)現(xiàn)，HDAC1基因的缺失將導(dǎo)致有絲分裂細(xì)胞的丟失和細(xì)胞死亡數(shù)量的增加〔8〕。Senese等〔9〕發(fā)現(xiàn)人腫瘤細(xì)胞缺乏HDAC1將不能進(jìn)行有絲分裂，細(xì)胞周期停滯在G1期或G2/M過(guò)渡期，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)使細(xì)胞通過(guò)半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3激活途徑發(fā)生凋亡。HDAC1 siRNA可下調(diào)固期蛋白A(Cyclin A)的表達(dá)，抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖〔10〕。張孟賢等〔3〕研究也發(fā)現(xiàn)，通過(guò)RNA干擾沉默大腸癌細(xì)胞系SW480 HDAC1基因，細(xì)胞發(fā)生G0/G1和G2/M期阻滯，并伴隨著明顯的細(xì)胞凋亡，且該過(guò)程可能與上調(diào)p21/WAF-1/CIP-1的表達(dá)抑制Cdk2與Cyclin E的表達(dá)有關(guān)。HDACi已被證實(shí)對(duì)多數(shù)基因的表達(dá)調(diào)控具有重要影響，特別是抑癌基因，HDACi能上調(diào)抑癌基因(如p21/WAF-1/CIP-1)表達(dá)，從而影響其他基因(如血管生長(zhǎng)因子)表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤作用〔6〕。研究〔11〕證明HDACi CG200745和CG006能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中p53的乙酰化導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞周期停滯、分化和凋亡。聯(lián)合應(yīng)用HDACi和DNMT1抑制劑可恢復(fù)乳腺癌細(xì)胞對(duì)內(nèi)分泌治療的敏感性〔12,13〕。除此之外，HDACi還具有抗炎、抗機(jī)體免疫的作用〔1〕。通過(guò)RT-PCR和免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)77%的胃癌患者組織HDAC1高表達(dá)，并認(rèn)為HDAC1在胃癌的預(yù)后中具有重要的價(jià)值〔14〕。然而，目前有關(guān)HDAC1與結(jié)直腸癌臨床意義的研究還沒(méi)有直接的報(bào)道。HDAC1在腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制目前還不明確，雖然通過(guò)免疫組化證實(shí)HDAC1與結(jié)直腸癌的臨床病理特征相關(guān)，但還需采取其他研究手段(如：WB和RT-PCR)。此外，還需進(jìn)一步擴(kuò)大單組樣本量。

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〔2014-12-07修回〕

(編輯袁左鳴)