通信作者:陳平(1958-)，女，教授，E-mail:chenpingvip24@163.com.

竹節(jié)參根狀莖總RNA提取方法的研究與優(yōu)化

吳亞運1,張紹鵬1,趙小龍1,宋佳1,陳平1，2

(武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023;湖北道地藥材分子生物學實驗室，湖北 武漢 430023)

摘要：針對竹節(jié)參根狀莖質(zhì)地堅硬、植物纖維多，富含多糖、酚類、蛋白質(zhì)及其他多種次生代謝產(chǎn)物的特點，研究竹節(jié)參根狀莖總RNA提取方法。分別運用Trizol法、Total RNA Kit植物提取試劑法、CTAB法進行總RNA的提取。借鑒人參根組織RNA的提取經(jīng)驗，根據(jù)竹節(jié)參的自身特點，有針對性的對CTAB法和Trizol法進行了優(yōu)化，樣品裂解后中加入PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮)和B-巰基乙醇去除酚類，并加入乙酸鈉營造出高濃度鈉離子環(huán)境去除多糖，之后再加入70%高氯酸鈉溶液去除蛋白質(zhì)，并對提取的總RNA進行電泳和OD值檢測與分析。優(yōu)化后的3種方法進行對比發(fā)現(xiàn)，對于竹節(jié)參總RNA的提取效果有較大差異，其中優(yōu)化的Trizol法提取的RNA電泳28S、18S條帶清晰，比值約為2：1，經(jīng)紫外光譜分析OD260/OD280比值為1.93，OD260/OD230比值為2.07，獲得了純度高、完整性好的總RNA。進一步以優(yōu)化的Trizol法提取所得RNA為模版進行反轉(zhuǎn)錄，并做RT-PCR，結(jié)果表明，RT-PCR的帶型特異穩(wěn)定，優(yōu)化方法提取的總RNA質(zhì)量穩(wěn)定可靠，適用于基因表達等后續(xù)分子生物學研究。優(yōu)化的Trizol法是一種適合于竹節(jié)參根狀莖總RNA抽提的簡單快速有效的方法。

關鍵詞：竹節(jié)參；RNA提?。籖T-PCR；根狀莖；多糖；多酚

收稿日期：2015-01-22.修回日期：2015-04-28.

作者簡介：吳亞運(1990-)，男，碩士研究生，E-mail:282595491@qq.com.

基金項目：湖北省教育廳科學研究青年項目(Q20141704).

文章編號：2095-7386(2015)03-0011-05

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2015.03.003

中圖分類號：Q 949;TQ 460.6

Analysis and optimization of high-quality RNA extraction

in rhizomesofPanaxjaponicusC.A.Mey

WUYa-yun1,ZHANGShao-peng1,ZHAOXiao-long1,SONGJia1,CHENPing1,2

(1.School of Biology and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China;

2.Lab of MolecularPharmacology of Traditional Chinese Medicine in Hubei, Wuhan 430023，China)

Abstract：Extraction of high-quality total RNA from the rhizomes secondary metaboli tes of Panax japonicus is always difficult due to rich fibers and hard tissues during the sampling grinding, and high levels of polyphenolcs, polysaccharides even secondary metabolies that coprecipitate with RNA during the RNA extraction. Three extraction methods, modified Trizol, Total RNA Kit plant extraction reagent method, modified CTAB were compared and improved to isolate RNA of rhizomes from Panax.japonicus. Especiallly of CTAB and Trizol method, the PVPP(Polyvinylpyrrolidone) and B-Mercaptoethanol were added after plant cell lysis so as to remove polyphenolcs. And Sodium acetate trihydrate and 70% Sodium perchlorate were then added to remove polysaccharides and protein. After these three methods, total RNA can be obtained with different RNA quality as determined by electrophoresis and UV-spectroscopic analysis. The modified Trizol method can extract high-quality and high-integrity RNA as determined by UV-spectroscopic analysis showing the OD260/OD280 at 1.93 and OD260/OD230 at 2.07. The electrophoresis profile showed that the lightness at 28S was 2 times higher than that at 18S. Then, the RNA were transcribed into complementary DNA (cDNA) by using poly(A) primer. The resulting cDNA were used for reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), which showed the stable and specific bands. These results indicate that our extracted RNA is suitable for gene expression analysis. The result showed that the modified Trizol method was simple, convenient, efficient for extracting Panax japonicus rhizomes total RNA.

Key words：PanaxjaponicusC.A.Mey;RNA extraction; RT-PCR;rhizomes;polysaccharide;polyphenol

1引言

竹節(jié)參(PanaxjaponicusC.A.Mey)是五加科人參屬植物。該植物的主要活性成分是次生代謝產(chǎn)物三萜皂苷，根狀莖則是其最常用的藥用部位[1]。竹節(jié)參兼具人參滋補和三七活血化瘀的功效，在我國南方土家苗族民間醫(yī)療中被譽為“萬草之王” ，市場應用前景十分廣泛。目前對竹節(jié)參的藥用研究主要集中于其有效成分、結(jié)構、藥理作用以及臨床應用等幾個方面，這是傳統(tǒng)中藥與現(xiàn)代藥物化學、藥理學、病理學的常規(guī)、宏觀的結(jié)合項目。但在微觀領域的分子層面，利用現(xiàn)代基因組與基因組學即基因的結(jié)構、表達、控制與功能分析和植物分子生物技術來影響植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的合成與調(diào)控等方面卻趨于空白。

要深入研究竹節(jié)參中基因遺傳學基礎對次生代謝產(chǎn)物的影響，獲取純度高、質(zhì)量好的總RNA就成為了首要前提。由于植物細胞壁及植物組織細胞中內(nèi)含物多，成分復雜且含有包括RNAse在內(nèi)的多種酶等因素的影響，使得植物組織RNA的提取相比于其它類型的組織樣本較為困難。竹節(jié)參屬人參屬，與人參相比較，在其根狀莖中不但含有多糖、多酚、色素、蛋白質(zhì)等人參組織中常見的與RNA結(jié)構相似或是易與RNA發(fā)生反應并產(chǎn)生沉淀的“特有物質(zhì)” ，而且竹節(jié)參根狀莖組織質(zhì)地更加堅硬、植物纖維更多、RNA的富含豐度更小，使得竹節(jié)參RNA的提取難度相比于人參組織更大[2]。鑒于此，筆者在人參根組織總RNA提取方法和經(jīng)驗的基礎上，結(jié)合竹節(jié)參的自身特點，嘗試了優(yōu)化的Trizol法、Total RNA Kit植物提取試劑法、優(yōu)化的CTAB法3種從竹節(jié)參根狀莖組織中提取總RNA的方法。經(jīng)過多次試驗和對提取結(jié)果的綜合比較，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化的Trizol法能夠快速簡單有效的提取出高質(zhì)量的總RNA。每克新鮮組織RNA產(chǎn)量在100—120 μg之間，電泳分析28sRNA熒光亮度約為18sRNA亮度的2倍，OD260/280值介于1.8—2.0之間，OD260/OD230值介于2.0—2.2之間。這就成為開展RT-PCR、RACE、CDNA文庫構建，進行基因克隆和基因表達分析等后續(xù)分子生物學實踐操作的基礎。

2材料與試劑

2.1實驗材料

6年生竹節(jié)參植株，采自湖北省恩施市人參培養(yǎng)基地。取新鮮竹節(jié)參根莖由自來水沖洗，70%乙醇浸泡消毒，無菌水沖洗后經(jīng)消毒濾紙吸干水分，于液氮中快速冷凍并保存于-80 ℃。

2.2實驗試劑

(1)CTAB提取液:2%CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide )；2%β-Mercaptoethanol；2%PVP(Polyvinylpyrrolidone);100mmol/L Tris-Hcl(pH8.0)；30mmol/L EDTA；2.0mmol/L Nacl；氯仿-異戊醇(24：1)；4mol/L LiCl。(2)SSTE:1mmol/L EDTA(pH8.0)；1.0mol/L Nacl；0.5%SDS；10mmol/L Tris-Hcl(pH8.0)。(3)用于總RNA提取操作使用的塑料制品如Eppendorf管(以下簡稱EP管)、槍頭等用0.1%DEPC水，37 ℃處理12 h，然后高壓滅菌后備用。玻璃器皿于180 ℃干熱滅菌6 h，電泳槽用3%雙氧水處理?？俁NA提取操作中的配置的溶液(Tris除外)均需經(jīng)0.1%DEPC水，37℃處理24 h，高壓滅菌后方可使用。含Tris的溶液用經(jīng)高壓滅菌的0.1%DEPC處理的水配置。(4)Trizol購自Invitrogen公司；Total RNA Kit試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；PVP、DEPC、SDS購自AMRESCO公司其它生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

3實驗方法和檢測

3.1優(yōu)化的CTAB法

(1)提取操作開始前先將CTAB提取液分裝，每管100 μL，置于水浴鍋中65 ℃預熱30 min。(2)稱0.1 g竹節(jié)參根狀莖樣本于經(jīng)液氮預冷的研缽中充分研磨至粉末，快速轉(zhuǎn)移樣本粉至裝有100 μL CTAB提取液的EP管中，立即渦旋振蕩30 s，65℃水浴鍋中水浴5min。(3)每管加入100 uL 氯仿/異戊醇(24：1)充分振蕩后，12 000 r/min 離心20min，轉(zhuǎn)移上清液到新的EP管中，重復氯仿/異戊醇(24:1)抽提一次。(4)轉(zhuǎn)移上清液到新的EP管，加入上清液1/2體積的4mol/L氯化鋰，-4℃過夜沉淀。(5)4℃ 12 000 r/min 離心20 min，棄上清液保留沉淀。(6)向管中加入500 μL 75%乙醇漂洗除去氯化鋰，室溫 12 000 r/min離心2 min 棄上清液后加入500μL SSTE溶解沉淀并將溶液轉(zhuǎn)移到新的EP管中，向管中加入500μL 氯仿/異戊醇(24:1)混勻，12 000 r/min離心20 min，取上清液到新的EP管中，加入上清液2倍體積的無水乙醇 -20 ℃沉淀2 h,4 ℃ 12 000 r/min 離心20 min沉淀RNA，棄上清液，加入400 μL 70%乙醇洗滌沉淀，4℃ 12 000 r/min 離心10 min。 再加入400μL 無水乙醇洗滌沉淀4℃ 12 000 r/min 10 min。(9)將得到的沉淀置于通風櫥中晾干，加入30 μL DEPC水，-80℃保存[3]。

3.2優(yōu)化的Trizol法

(1)稱0.1g竹節(jié)參根狀莖樣本于經(jīng)液氮預冷研缽中充分研磨至粉末，快速轉(zhuǎn)移樣本粉末至裝有1mL Triaol裂解液的EP管中，渦旋混勻后室溫靜置10min。(2)4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min棄沉淀，收集上清液至新的EP管中。(3)向EP管中加入200 μL 氯仿，50μL 乙酸鈉(2mol/L)，15μL B-巰基乙醇，2%pvp5μL渦旋混勻，冰浴10 min，使反應充分進行。(4)4 ℃ 12 000 r/min 離心15 min，收集上清液至新的EP管中，加入70%高氯酸鈉200 μL充分混勻后 4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min 棄沉淀 轉(zhuǎn)移上清液至新的EP管中。(6)向EP管中加入與上清液等體積的異丙醇和200 μL乙酸鈉(3mol/L) 顛倒混勻 -20℃沉淀1h(7)4℃ 12 000r/min 離心10 min 棄上清液 后用1mL 75%乙醇洗滌沉淀在溫度為4 ℃時，12 000 r/min 離心5 min 棄上清液(重復一次)。(8)將得到的沉淀置于通風櫥中晾干，加入30 μL DEPC水，-80℃保存[3]。

3.3Total RNA Kit植物提取試劑法

(1)稱0.1g竹節(jié)參根狀莖樣本于經(jīng)液氮預冷研缽中充分研磨至粉末，快速轉(zhuǎn)移樣本粉末至裝有1mL TRNsol裂解液的EP管中，渦旋混勻。(2)每1mL TRNsol中加入200 μL 氯仿，劇烈震蕩15s，冰上放置5 min。室溫12 000 r/min 離心10 min。(3)將上層水相體積80%轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入水相體積70%的無水乙醇，混勻。(4)將混合液全部注入GBC吸附柱中，12 000 r/min 離心30 s。(5)離心后棄掉收集管中的廢液，向GBC吸附柱中加入500 μL wash buffer 1 室溫 12 000 r/min 離心1 min 后棄廢液。(6)向GBC吸附柱中加入600 μL wash buffer 2，室溫 12 000 r/min，離心30 s 棄廢液。(7)再向GBC吸附柱中加一次600 μL wash buffer 2 離心30 s 棄廢液 將GBC吸附柱放入新的收集管中。(8)室溫 12 000 r/min 空離1 min棄廢液，以徹底去除吸附柱中的漂洗液。(9)將GBC吸附柱放入新的收集管中，向柱中加入30 μL DEPC水，室溫放置2 min,12 000 r/min離心1 min得到RNA，-80℃保存。

3.4竹節(jié)參總RNA質(zhì)量檢測

3.4.1RNA完整性檢測

RNA的非變性瓊脂糖凝膠電泳在1×TBE中進行，瓊脂糖濃度為1%(每100mL凝膠中加入2 μLEB)。反應條件為：5 μL上樣量，180V恒壓，20min，而后于紫外凝膠成像儀中觀察總RNA完整性。

3.4.2RNA純度及產(chǎn)率檢測

運用紫外分光光度計測定總RNA樣本在230 nm、260 nm、280 nm處的吸光。取1 uL總RNA溶液，溶于1mL經(jīng)DEPC處理的去離子水中，檢測其吸光度值。無污染的總RNA其OD260/OD280為1.8—2.0，OD260/OD230為2.0—2.2。并可通過吸光度值得出RNA濃度：即每單位OD260的RNA濃度為40 μg/mL，RNA產(chǎn)率公式：(μg/g)=[OD260×稀釋倍數(shù)×40 μg/mL×Vrna(mL)]/材料質(zhì)量。

3.4.3RT-PCR

以TaKaRa公司AMV反轉(zhuǎn)錄酶操作說明，合成cDNA第一鏈，再以常規(guī)的PCR法擴增cDNA第二鏈。PCR(25 μL)體系包括：2 μL cDNA，15mmol/L MgCl2，1U Taq酶，0.2mmol dNTP，正向和反向引物各1mmol，根據(jù)NCBI人參16S核糖體RNA基因序列設計其特異引物D1、D2(引物序列為，正向引物D1：5’-GCTCGTGTCGTGAGATGTT-3’；反向引物D2：5’-TGTAGCCCAGGTCATAAGG-3’，上海桑尼生物科技有限公司合成)。擴增條件為：cDNA模版先于94 ℃變性3 min，再經(jīng)35個循環(huán)擴增(94℃變性55 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min)，最后72℃延伸8min。擴增完成后取4組產(chǎn)物每組5 μL于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

4結(jié)果與分析

4.1總RNA電泳檢測

采用1%瓊脂糖凝膠電泳對總RNA的完整性進行檢測(見圖1)。

生物體內(nèi)總RNA中rRNA含量最多，所以提取組織的總RNA中得到最多的就是rRNA。rRNA在植物組織中較多的是5 s、18 s和28 s，其中28 s和18 s含量多于5 s，所以電泳檢測中的關鍵特征條帶實際上就是28 s和18 s這兩條帶。28 s大約為4KNT而18 s為2KNTt，在細胞內(nèi)28 S和18 S的分子數(shù)相同的(來源于同一個轉(zhuǎn)錄本)，28 S的質(zhì)量應該是18 S質(zhì)量的2倍，電泳時插入28 S中的核酸燃料數(shù)量為18 S的2倍，所以條帶的熒光亮度也是2倍。據(jù)圖1中結(jié)果表明，優(yōu)化的CTAB法提取的總RNA，18 s、28 s兩條帶十分模糊，在條帶周圍存在明顯的拖帶現(xiàn)象，說明得到的RNA降解嚴重。Total RNA Kit植物提取試劑法得到的總RNA能夠看到兩條帶，但是28 s和18 s條帶的熒光亮度幾乎相等，未呈現(xiàn)出2倍的關系，說明提取得到的RNA有部分降解。優(yōu)化的Trizol法提取的總RNA，在電泳后呈現(xiàn)出兩條明顯的條帶，28 s和18 s兩條特征條帶的熒光亮度接近2∶1，表明總RNA沒有降解，也無明顯的DNA和蛋白質(zhì)污染。

圖1　電泳圖

4.2總RNA質(zhì)量檢測

采用紫外分光光度計對總RNA的純度及產(chǎn)率進行檢測結(jié)果見表1。

純凈RNA的OD260/OD280比值的正常范圍是1.8—2.0，比值小于1.8說明可能存在蛋白質(zhì)或酚類等有機物的污染，比值大于2.0說明可能有殘留的B-巰基乙醇。純凈RNA的OD260/OD230比值的正常范圍是2.0—2.2，比值大于2.2說明RNA已水解為單核酸，比值小于2說明可能存在次生代謝產(chǎn)物(如萜類)干擾，通過吸光度值得出RNA濃度即每單位OD260的RNA為40 μg/mL，而RNA產(chǎn)率(ug/g)=[OD260×稀釋倍數(shù)×40 μg/mL×Vrna(mL)]/材料質(zhì)量。由表1中結(jié)果表明，優(yōu)化的Trizol法提取的總RNA純度較好，適宜于后續(xù)的實驗研究。

表1純度與產(chǎn)率

方法OD230nm260nm280nmOD260/OD280OD260/OD230產(chǎn)率/(μg/g)優(yōu)化的CTAB法0.0070.0120.0081.501.7148TotalRNAKit植物提取試劑法0.0090.0170.0101.701.8968優(yōu)化的Trizol法0.0140.0290.0151.932.07116

4.3RT-PCR

以優(yōu)化的Trizol法提取的竹節(jié)參根狀莖總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA為模版，人參16S核糖體RNA基因特異引物D1、D2為引物進行RT-PCR，預期擴增的目的片段長度為500 bp。實驗結(jié)果表明(圖2)，已成功擴增出預計的目的片段，且目的片段條帶清晰、長度相適，瓊脂糖凝膠上亦未出現(xiàn)非特異產(chǎn)物。由此說明，優(yōu)化的Trizol法提取得到了適宜于開展分子克隆和基因表達等后續(xù)分子生物學實驗與研究所需的高質(zhì)量RNA。

圖2

5討論

在竹節(jié)參根狀莖總RNA的提取過程中，由于其質(zhì)地堅硬，富含植物纖維，磨樣困難。且根狀莖組織中多糖、多酚含量高，在生長成熟過程中積累了許多的水解酶和色素,使得常規(guī)的提取方法無法從竹節(jié)參中獲得高質(zhì)量的RNA。探究其原因，是由于沒有特殊針對性的試劑來去除這些雜質(zhì)，導致RNA的損失。本研究中提取總RNA效果最好的方法，優(yōu)化的Trizol法，在多次常規(guī)方法操作經(jīng)驗的基礎上，有針對性的增加選用了除雜試劑、改進了實驗操作步驟。檢驗結(jié)果表明，實驗提取得到了高質(zhì)量的總RNA。

酚類物質(zhì)：在氧化條件下易被氧化成醌類。在常規(guī)實驗操作中，有醌類物質(zhì)的存在就會使處理液變?yōu)楹稚翌伾珪S氧化程度的增加而加深，結(jié)果就是醌類與RNA發(fā)生不可逆結(jié)合并產(chǎn)生沉淀，導致RNA的大量損失。針對這種情況，在本次操作中加入了PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮)和B-巰基乙醇。B-巰基乙醇是強還原劑，能夠產(chǎn)生還原環(huán)境防止多酚被氧化。PVPP是多酚類化合物的螯合劑，其中的O=C-N=基有很強的結(jié)合多酚化合物的能力。這兩種試劑相互協(xié)作，B-巰基乙醇產(chǎn)生還原環(huán)境，使多酚保存原狀并與PVPP充分結(jié)合，由后續(xù)的抽提步驟將它們?nèi)コ齕4]。在實驗操作中發(fā)現(xiàn)，單一的加入B-巰基乙醇或是PVPP都無法有效的抑制多酚物質(zhì)的氧化，兩種試劑一起加入效果最好。多糖類：多糖在竹節(jié)參的根狀莖中含量接近50%，它的理化性質(zhì)與RNA相似，使得它們很難分離。在提取過程中，常規(guī)的氯仿分層抽提在除多糖的同時也會有RNA的損失。在沉淀RNA時，會產(chǎn)生大量白色沉淀，這些沉淀難溶于水或是溶解后產(chǎn)生黏稠狀溶液，由于多糖可抑制多種酶的活性，受到多糖污染的RNA根本無法用于下一階段的分子研究[5]。針對這種情況，在本次操作中加入了大量的乙酸鈉，營造出高濃度的鈉離子環(huán)境，在這種條件下，多糖會溶解在高濃

度的鹽溶液中而RNA則會析出，通過氯仿和醇的抽提，可〗以很好的去除多糖雜質(zhì)。在常規(guī)提取過程中，蛋白質(zhì)是另外一個重要的障礙，在Trizol裂解液中，含有異硫氰酸胍、B-巰基乙醇等蛋白質(zhì)變性劑，后續(xù)步驟中的氯仿也能變性蛋白質(zhì)[6-7]。但Trizol法的工作容量是有限度的，當?shù)鞍踪|(zhì)含量較為豐富時，有的蛋白質(zhì)就不會沉淀在中間層，而是溶解在上層液中。在竹節(jié)參根狀莖RNA提取常規(guī)操作中，即使反復的加入氯仿分層抽提多次，依然可以清晰看到中間層的白色蛋白質(zhì)沉淀，并且加入異丙醇后，會產(chǎn)生白色絮狀沉淀，說明依然有蛋白質(zhì)殘留。針對這種情況，在本次試驗操作中加入了70%高氯酸鈉溶液，在此溶液中RNA的溶解度大于蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)能在離心后沉淀下來。取上清液后加入2倍體積無水乙醇，RNA會在其中沉淀而殘留的蛋白質(zhì)會溶解在無水乙醇中，再次離心保留沉淀，就能較好的除去蛋白質(zhì)。橫向?qū)Ρ任闹械?種方法，在相同的實驗條件下。優(yōu)化的Trizol法，操作更簡便、耗時更短，樣本處理液始終處于強變性劑中。這些特點降低了RNA在提取過程中被降解的概率，進一步確保了實驗結(jié)果的有效性。

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