劉夢鶴，李捷鑫，田樹軍，2*，蘇文龍，孟娜娜，王寒陽，李俊杰，2，孫樹春，2

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定071000；2.河北省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，河北保定071000）

卵母細(xì)胞體外成熟過程中CTSB、CTSS和caspase 3活性與表達(dá)量的變化

劉夢鶴1，李捷鑫1，田樹軍1，2*，蘇文龍1，孟娜娜1，王寒陽1，李俊杰1，2，孫樹春1，2

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定071000；2.河北省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，河北保定071000）

CTSB、CTSS和caspase 3對細(xì)胞凋亡具有重要作用，其活性和蛋白表達(dá)量可反映細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境對卵母細(xì)胞的凋亡刺激。本研究利用雙夾心ELISA方法測定綿羊卵母細(xì)胞內(nèi)CTSB、CTSS和caspase 3在IVM 0、8、16、24 h的活性與蛋白表達(dá)量，研究其在IVM過程中的變化、與卵母細(xì)胞質(zhì)量的相關(guān)性及E-64對其產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明：質(zhì)量差組卵母細(xì)胞內(nèi)CTSB、CTSS和caspase 3活性與CTSB蛋白表達(dá)量均極顯著高于正常質(zhì)量組（P＜0.01）；CTSB、CTSS活性和蛋白表達(dá)量在IVM過程中無顯著變化（P＞0.05），caspase 3活性呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，蛋白表達(dá)量無顯著變化（P＞0.05）；5 μmol/L和10 μmol/L E-64顯著或極顯著降低了CTSB、CTSS和caspase 3活性（P＜0.05 or P＜0.01），10 μmol/L E-64顯著提高了CTSB蛋白表達(dá)量（P＜0.05）。結(jié)果顯示，CTSB、CTSS和caspase 3的活性及CTSB蛋白表達(dá)量與卵母細(xì)胞質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)，E-64可降低CTSB、CTSS和caspase 3活性，并提高CTSB蛋白表達(dá)量。

綿羊；卵母細(xì)胞；組織蛋白酶；caspase 3；ELISA

組織蛋白酶B、S(CTSB、CTSS)屬于溶酶體內(nèi)半胱氨酸蛋白酶家族中的成員,通過激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶(caspase)3開啟凋亡通路［1］。CTSB普遍存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中［2］,主要分解細(xì)胞內(nèi)蛋白［3］；CTSS僅存在于與其功能有關(guān)的主要組織相容性復(fù)合體中［4］,對細(xì)胞外高分子物質(zhì)如層茹連蛋白、膠原蛋白和彈性蛋白進(jìn)行分解［5］,在細(xì)胞凋亡和胚胎附植上發(fā)揮重要作用［6-7］。E-64(L-反-環(huán)氧琥珀酸-L-亮酸胺4-胍丁烷)作為一種組織蛋白酶抑制劑,可有效抑制組織蛋白酶B活性［8］。

有研究表明,在牛卵丘中和卵母細(xì)胞內(nèi),CTSB、CTSS mRNA表達(dá)量均與卵母細(xì)胞發(fā)育能力呈負(fù)相關(guān)［9-10］。Balboula等［11-12］發(fā)現(xiàn),牛卵母細(xì)胞和胚胎中CTSB活性和表達(dá)量均與卵母細(xì)胞和胚胎的質(zhì)量呈負(fù)相關(guān),當(dāng)卵母細(xì)胞受到凋亡刺激后,caspase 3的活性和表達(dá)量會顯著升高［13］。劉志濤等［14］報(bào)道,綿羊卵母細(xì)胞體外成熟液中添加E-64可降低CTSB和CTSS mRNA表達(dá)量,提高卵母細(xì)胞后續(xù)發(fā)育能力；Balboula等［11-12］報(bào)道,E-64可降低牛卵丘細(xì)胞和胚胎細(xì)胞的凋亡率。本研究通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定綿羊卵母細(xì)胞內(nèi)CTSB、CTSS和caspase 3的活性和蛋白表達(dá)量,探究這三種酶的活性和蛋白表達(dá)量與卵母細(xì)胞質(zhì)量間的關(guān)系、體外成熟(IVM)過程中的變化及E-64對其產(chǎn)生的影響,為提高卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料試驗(yàn)所用綿羊卵巢采集于河北唐縣屠宰場,離體卵巢獲得后立即被放入30℃、青霉素和鏈霉素濃度均為100 IU/mL的生理鹽水中,并在2～3 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)試劑以下試劑若無特殊說明,均購自

Sigma aldrich公司。

卵母細(xì)胞成熟液：TCM199+100 mol/L半胱氨酸+10 g/mL促卵泡素(Bioniche,Canada)+10 g/mL促黃體素(Bioniche,Canada)+1 g/mL雌二醇+10%胎牛血清(Gibco)。

采卵液：TCM199(Gibco)+5 mmol/L NaHCO3+ 10 mmol/L Hepes+10 mmol/L Hepes-Na+0.01 g/L肝素鈉+10 mL/L胎牛血清(Gibco)+0.025 g/L青霉素+ 0.025 g/L鏈霉素。

1.3 卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)的收集將綿羊卵巢移入燒杯,用38.5℃生理鹽水沖洗3～5次,置于水浴鍋內(nèi)。將卵巢置于放有采卵液的培養(yǎng)皿中,選取卵巢上直徑為2～6 mm的卵泡用刀片進(jìn)行切割。利用口吸管在顯微鏡下收集COCs。挑選形態(tài)正常、卵丘細(xì)胞不少于3層的COCs作為正常質(zhì)量組；胞質(zhì)不均勻、無或僅有少量卵丘細(xì)胞包匣的卵母細(xì)胞作為質(zhì)量差組。

1.4 卵母細(xì)胞體外成熟將COCs分別移入E-64濃度分別為0、5、10 μmol/L的熟液滴中,微滴體積為100 μL置于38.5℃、飽和濕度和5%CO2的條件下進(jìn)行體外成熟。

1.5 樣品收集在IVM 0、8、16、24 h收集正常質(zhì)量組中的卵母細(xì)胞,IVM 24 h收集質(zhì)量差組中的卵母細(xì)胞。將COCs置于PVA含量為1 g/L的DPBS(Gibco)中并移入1.5 mL離心管,用移液槍反復(fù)吹打,直至卵丘細(xì)胞從卵母細(xì)胞上完全脫離,用DPBS洗3遍,最終移入200 μL離心管中,每個(gè)離心管中含50個(gè)卵母細(xì)胞。每組樣品均進(jìn)行3次重復(fù)采樣。

1.6 樣品裂解用移液槍測量保存樣品的200 μL離心管中液體體積,加入DPBS,使離心管中液體總體積均為70 μL,并用超聲波勻漿儀對樣品進(jìn)行裂解。

1.7 ELISA利用測定CTSB、CTSS和caspase 3活性或蛋白表達(dá)量的6種雙夾心ELISA試劑盒(慧穎應(yīng)用生物科技公司),分別對裂解液中的6個(gè)指標(biāo)進(jìn)行測定,按照說明書進(jìn)行操作在酶標(biāo)包被板上設(shè)10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品孔,按照說明書將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成5個(gè)濃度梯度,每個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品占2個(gè)孔,每個(gè)加樣孔加樣量為50 μL；每個(gè)待測樣品孔加入10 μL裂解液,40 μL樣品稀釋液,37℃溫育30 min后,棄去液體,在每個(gè)加樣孔加滿洗滌液,30 s后棄去洗滌液,并重復(fù)5次；向加樣孔加入50 μL酶標(biāo)試劑,利用上述方法溫育和洗滌后,每個(gè)加樣孔依次加入顯色劑A和顯色劑B各50 μL,37℃避光顯色15 min；向每個(gè)加樣孔加入50 μL終止液,15 min后在酶標(biāo)儀中以450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)；最后利用標(biāo)準(zhǔn)品的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,利用樣品OD值計(jì)算樣品中CTSB、CTSS和caspase 3的活性和蛋白表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)結(jié)果利用SPSS 17.0進(jìn)行One-Wway ANOVA分析及Ducan′s檢驗(yàn),P＜0.05表示差異顯著,P＜0.01表示差異極顯著,P＞0.05表示差異不顯著,結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果

2.1 不同質(zhì)量卵母細(xì)胞內(nèi)CTSB、CTSS和caspase 3活性和蛋白表達(dá)量的比較由表1可以看出,體外成熟24 h后,質(zhì)量差的卵母細(xì)胞內(nèi)CTSB、CTSS和caspase 3活性均極顯著高于質(zhì)量正常的卵母細(xì)胞(P＜0.01),而在3種酶蛋白表達(dá)量上的對比表明,2種卵母細(xì)胞僅在CTSB蛋白表達(dá)量上存在極顯著差異(P＜0.01)。

表1 不同質(zhì)量卵母細(xì)胞內(nèi)CTSB、CTSS和caspase 3酶活性及蛋白表達(dá)量對比

2.2 E-64對卵母細(xì)胞內(nèi)CTSB、CTSS和caspase 3活性變化的影響不同濃度E-64對卵母細(xì)胞內(nèi)CTSB活性變化的影響如表2所示。對照組卵母細(xì)胞于IVM 0、8、16、24 h CTSB活性保持穩(wěn)定(P＞0.05)；5 μmol/L E-64組,CTSB活性僅在IVM 8 h時(shí)顯著低于IVM 0 h組和對照組中卵母細(xì)胞內(nèi)CTSB活性(P＜0.05)；10 μmol/L E-64組在體外成熟過程中一直顯著或極顯著低于0 h組和對照組(P＜0.05或P＜0.01)。5 μmol/L E-64組和10 μmol/L E-64組之間無顯著差異(P＞0.05)。

由表3可知,對照組卵母細(xì)胞內(nèi)CTSS活性無顯著變化(P＞0.05)。E-64試驗(yàn)組中CTSS活性呈下降趨勢,其中5 μmol/L E-64組中CTSS活性僅在體在IVM 24 h時(shí)顯著低于對照組(P＜0.05)；10 μmol/L E-64組中CTSS活性在IVM 8 h和24 h顯著或極顯著低于對照組(P＜0.05或P＜0.01),而在IVM 16 h與對照組無顯著差異(P＞0.05)；10 μmol/L E-64組在IVM 24 h時(shí)顯著低于5 μmol/L E-64組(P＜0.05)。

由表4可知,在IVM過程中,卵母細(xì)胞內(nèi)caspase 3活性呈先降低后升高的趨勢,IVM 8 h除對照組卵母細(xì)胞內(nèi)caspase 3活性與IVM 0 h組無顯著差異(P＞0.05)外,各E-64試驗(yàn)組中caspase 3活性均顯著或極顯著低于(P＜0.05、P＜0.01)IVM 0 h組,并且IVM 24 h時(shí)各組卵母細(xì)胞內(nèi)caspase 3活性均顯著或極顯著(P＜0.05、P＜0.01)高于IVM 8 h。10 μmol/L E-64組中caspase 3活性均顯著低于對照組(P＜0.05),5 μmol/L E-64組與對照組和10 μmol/L E-64組無顯著差異(P＞0.05)。

2.3 E-64對卵母細(xì)胞內(nèi)CTSB、CTSS和caspase 3蛋白表達(dá)量的影響E-64對卵母細(xì)胞內(nèi)CTSB、CTSS和caspase 3蛋白表達(dá)量的影響如表5、6、7所示,IVM過程中卵母細(xì)胞內(nèi)CTSB、CTSS和caspase 3蛋白表達(dá)量無顯著變化(P＞0.05)；5 μmol/L和10 μmol/L E-64對卵母細(xì)胞內(nèi)CTSS和caspase 3蛋白表達(dá)量無顯著影響(P＞0.05)；10 μmol/L E-64組中CTSB蛋白表達(dá)量在IVM 24 h時(shí)顯著高于IVM 0 h和8 h(P＜0.05),且顯著高于(P＜0.05)IVM 24 h對照組內(nèi)CTSB蛋白表達(dá)量。

表2 不同濃度E-64對卵母細(xì)胞內(nèi)CTSB活性的影響IU·L-1

表3 不同濃度E-64對卵母細(xì)胞內(nèi)CTSS活性的影響IU·L-1

3 討論

3.1 不同質(zhì)量卵母細(xì)胞內(nèi)CTSB、CTSS和caspase 3活性及蛋白表達(dá)量的差異CTSB和CTSS在凋亡信號傳導(dǎo)上具有重要作用,caspase 3的活化發(fā)生在凋亡早期。組織蛋白酶介導(dǎo)凋亡的過程中,組織蛋白酶會從溶酶體中釋放出來,促使線粒體中細(xì)胞色素C進(jìn)行釋放,激活caspase 9,最后激活caspase 3,繼而開啟凋亡通路［15］。Balboula［11,13］在牛卵母細(xì)胞上的研究表明,質(zhì)量差的卵母細(xì)胞內(nèi)CTSB活性和蛋白表達(dá)量高于質(zhì)量正常的卵母細(xì)胞,并且在體外成熟過程中,利用熱應(yīng)激對卵母細(xì)胞給予凋亡刺激后,CTSB和caspase 3的活性和蛋白表達(dá)量均會顯著升高。質(zhì)量差的卵母細(xì)胞周匣缺少卵丘細(xì)胞,因此更容易受到活性氧等因素引起的凋亡刺激［16］。本試驗(yàn)結(jié)果表明,在IVM 24 h時(shí),質(zhì)量差卵母細(xì)胞內(nèi)CTSB、CTSS和caspase 3活性均極顯著高于質(zhì)量正常的卵母細(xì)胞,與Balboula［11,13］的研究結(jié)果一致,由此可推斷,在體外成熟過程中,質(zhì)量差組中的卵母細(xì)胞受到了較正常質(zhì)量組更高水平的凋亡刺激。然而蛋白表達(dá)量的測定結(jié)果表明,只有CTSB蛋白表達(dá)量與卵母細(xì)胞質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)性,與Balboula等［13］結(jié)果不一致,因此質(zhì)量差組中的卵母細(xì)胞在體外成熟過程中所受到的凋亡刺激,在種類或程度上不同于熱應(yīng)激產(chǎn)生的凋亡刺激,同時(shí),相較于CTSS和caspase 3,CTSB在凋亡過程中起到了更為重要的作用。

表4 不同濃度E-64對卵母細(xì)胞內(nèi)caspase 3活性的影響IU·L-1

表5 不同濃度E-64對卵母細(xì)胞內(nèi)CTSB蛋白表達(dá)量的影響pg·mL-1

表6 不同濃度E-64對卵母細(xì)胞內(nèi)CTSS蛋白表達(dá)量的影響pg·mL-1

表7 不同濃度E-64對卵母細(xì)胞內(nèi)caspase 3蛋白表達(dá)量的影響ng·mL-1

3.2 E-64對卵母細(xì)胞內(nèi)CTSB、CTSS和caspase 3活性變化和蛋白表達(dá)量的影響E-64作為特異性組織蛋白酶抑制劑,僅對CTSB、CTSH(組織蛋白酶H)和CTSL(組織蛋白酶L)活性產(chǎn)生抑制作用［13］。卵母細(xì)胞在IVM 0、8、16 h和24 h分別處于GV期(生發(fā)泡期)、GVBD期(生發(fā)泡破裂期)、MⅠ期(第1次減數(shù)分裂中期)和MⅡ期(第2次減數(shù)分裂中期),因此這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)能較為準(zhǔn)確地反映CTSB、CTSS和caspase 3在體外成熟過程中的變化。然而結(jié)果表明,E-64組中CTSB、CTSS和caspase 3的活性均有所降低,因此CTSB、CTSS和caspase 3的活性之間可能存在聯(lián)系。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激后,CTSB和CTSS從溶酶體中釋放出來,最終活化caspase 3,開啟凋亡通路［15］。因此當(dāng)CTSB活性受到抑制后,caspase 3活性也會隨之降低。CTSS活性的降低表明E-64組中卵母細(xì)胞受到較對照組中卵母細(xì)胞更低的凋亡刺激,由于CTSB對細(xì)胞內(nèi)蛋白分解上具有重要作用［2］,并且E-64組中CTSB和caspase 3活性均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢,因此推斷,在離體卵巢運(yùn)輸和卵母細(xì)胞收集過程中,外界對卵母細(xì)胞產(chǎn)生的凋亡刺激促使CTSB從溶酶體中釋放出來,除傳導(dǎo)凋亡信號外,CTSB還對細(xì)胞內(nèi)蛋白進(jìn)行分解,而其中部分蛋白分解過程是不必要的,由此對卵母細(xì)胞產(chǎn)生了來自于細(xì)胞內(nèi)的凋亡刺激,因此當(dāng)CTSB活性受到抑制后,來自于細(xì)胞內(nèi)的凋亡刺激減弱,CTSS的活性也隨之降低。

Bettegowda等［9］研究表明,10 μmol/L E-64組中卵丘細(xì)胞凋亡率顯著低于1 μmol/L E-64組,但兩試驗(yàn)組在囊胚率上沒有差異。劉志濤等［14］發(fā)現(xiàn),5、10 μmol/L E-64可顯著降低卵丘細(xì)胞內(nèi)CTSB和CTSS基因表達(dá)量,并提高囊胚發(fā)育率,但是兩試驗(yàn)組之間無顯著差異。本研究結(jié)果顯示,10 μmol/L E-64組中卵母細(xì)胞內(nèi)CTSB活性與5 μmol/L E-64組無差異,蛋白表達(dá)量顯著高于對照組,表明過度抑制CTSB活性會刺激CTSB的表達(dá)。因此推斷,體外成熟過程中卵母細(xì)胞內(nèi)CTSB活性須保持在一定水平以上,使其在除傳導(dǎo)凋亡信號的其他生理活動(dòng)中發(fā)揮作用或在體外成熟后作為母源物質(zhì)積累,因此10 μmol/L或更高濃度的E-64不但不會繼續(xù)提高卵母細(xì)胞的發(fā)育能力,還可能會影響其正常生理活動(dòng)產(chǎn)生。

4 結(jié)論

綿羊卵母細(xì)胞在體外成熟過程中,CTSB、CTSS和caspase 3蛋白表達(dá)量保持穩(wěn)定,CTSB和CTSS活性沒有顯著變化,caspase 3活性呈先降低后升高的趨勢。CTSB、CTSS和caspase 3活性及CTSB蛋白表達(dá)量與體外成熟后卵母細(xì)胞質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)。成熟液中添加E-64可以降低卵母細(xì)胞內(nèi)CTSB、CTSS和caspase 3的活性,10 μmol/L E-64可以提高卵母細(xì)胞內(nèi)CTSB的蛋白表達(dá)量。

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Changes of Activity and Protein Expression of CTSB，CTSS and caspase 3 in Oocytes During in vitro Maturation

LIU Meng-he1,LI Jie-xin1,TIAN Shu-jun1,2*,SU Wen-long1,MENG Na-na1,WANG Han-yang1, LI Jun-jie1,2,SUN Shu-chun1,2
（1.College of Animal Science and Technology,Agricultural University of Hebei,Hebei Baoding 071000,China；2.Embryo Engineering and Technological Center of Cattle and Sheep,Hebei Baoding 071000,China）

CTSB,CTSS and caspase 3 pla y important role in apoptosis,and activities and protein expressions of them can reflect death signals induced by intracellular and extracellular environment.This study was aimed to discover changes of activities and protein expression of CTSB,CTSS and caspase 3 and the relation to the quality of oocytes through detecting activities and protein expressions of CTSB,CTSS and caspase 3 in sheep oocytes at IVM 0,8,16 h and 24 h.Double antibody sandwich ELISA method was undertaken to detect activities and protein expressions,the correlation with the quality of oocytes and the effect of E-64 on them.The results showed that activities of CTSB, CTSS and caspase 3 and the protein expressions in oocytes quality poor were very significantly high compared with the normal ones.There was no significant fluctuation（P＞0.05）of CTSB and CTSS activities during IVM time,at the same time,there were no significant changes（P＞0.05）in protein expressions either,but the activity of caspase 3 showed a significant fluctuation（P＜0.05）.Addition of 5 μmol/L and 10 μmol/L E-64 significantly and very significantly（P＜0.05,P＜0.01）decreased the activities of CTSB,CTSS and caspase 3,and 10 μmol/L E-64 increased the protein expressions of CTSB.According to the results,the activities of CTSB,CTSS and caspase 3 and the protein expression of CTSB were negatively correlated with the quality of oocytes,and the addition of E-64 can to decrease the activities of CTSB,CTSS and caspase 3 and increase the protein expressions of CTSB.

sheep；oocytes；cathepsins；caspase 3；ELISA

S826.3

A

0258-7033（2015）09-0021-05

2014-10-04；

2014-11-17

河北省自然科學(xué)基金（C2012204084）；國家科技支撐計(jì)劃（2011BAD19B02-6）

劉夢鶴（1989-），男，河北唐山人，碩士研究生，從事動(dòng)物胚胎工程技術(shù)研究，E-mail：liumengheyouxiang@163.com

*通訊作者：田樹軍，男，教授，博導(dǎo)，E-mail：tsj7890@126.com