孫澤威，仲慶振，婁玉杰

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118）

急性熱應(yīng)激鵝心和肝和肺及腎臟組織中HSP70 mRNA及蛋白的表達(dá)

孫澤威，仲慶振，婁玉杰*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118）

選取1日齡健康雁鵝60只，隨機(jī)分為6組，單籠飼養(yǎng)于環(huán)控倉(cāng)內(nèi)。6周齡時(shí)，A組置于（22±1）℃作為對(duì)照，B、C、D、E、F組分別施于2、4、6、8 h和10 h （40±1）℃的急性熱應(yīng)激處理，處理后立即剖殺，取心、肝、肺和腎臟組織，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定HSP70mRNA表達(dá)量，免疫組織化學(xué)方法測(cè)定HSP70表達(dá)量。結(jié)果表明：急性熱應(yīng)激處理可顯著提高各組織中HSP70 mRNA及HSP70蛋白的表達(dá)水平，但不同組織出現(xiàn)顯著變化的時(shí)間以及隨熱應(yīng)激時(shí)間延長(zhǎng)的變化規(guī)律存在差異。心臟組織HSP70mRNA和蛋白表達(dá)量均在熱應(yīng)激2 h后出現(xiàn)顯著升高（P＜0.05），熱應(yīng)激4 h后達(dá)到最高值，8 h后降至對(duì)照組水平，遵循二次曲線(xiàn)回歸模式；肝臟熱應(yīng)激4～10 h間HSP70及其mRNA均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），但未表現(xiàn)出顯著的線(xiàn)性與二次回歸趨勢(shì)；肺臟HSP70mRNA表達(dá)水平在熱應(yīng)激2～10 h間顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），HSP70則從熱應(yīng)激4 h起才顯著升高，但二者隨熱應(yīng)激時(shí)間延長(zhǎng)均呈顯著的線(xiàn)性升高規(guī)律；與肺相似，腎臟HSP70及其mRNA表達(dá)量隨熱應(yīng)激時(shí)間的變化趨勢(shì)也遵循線(xiàn)性回歸模式，兩者均在熱應(yīng)激4～10 h顯著升高（P＜0.05）。

熱應(yīng)激；熱休克蛋白70；鵝

應(yīng)激是機(jī)體在基因水平上發(fā)動(dòng)的全面抗脅迫過(guò)程,應(yīng)激條件下機(jī)體能迅速激活一些基因,表達(dá)出一系列分子量不同的熱休克蛋白(HSPs)參與機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)［1-2］。HSP70是熱應(yīng)激蛋白中最重要的家族,具有普遍性、高度保守性及應(yīng)激性,并通過(guò)分子伴侶作用、抗氧化作用、協(xié)同免疫作用和抗細(xì)胞凋亡作用抵抗應(yīng)激危害［3］。在家禽熱應(yīng)激方面,嚴(yán)建燕［4］、孫培明［5］、雷蕾［6］等分別針對(duì)不同熱應(yīng)激溫度和時(shí)間條件下,雞主要器宮組織中HSP60、HSP70、HSP90及其mRNA的表達(dá)進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究,進(jìn)一步證實(shí)了熱休克蛋白的應(yīng)激保護(hù)作用。但對(duì)于水禽熱應(yīng)激的研究,國(guó)內(nèi)外均剛剛起步,僅吳曉平等［7］和仲慶振［8］就鵝的熱應(yīng)激方面開(kāi)展了一些工作。仲慶振［8］研究發(fā)現(xiàn),急性熱應(yīng)激可在一定程度上損傷鵝心、肝、脾、肺、腎等器宮組織,且不同器宮組織的損傷程度存在顯著差異。但伴隨著鵝熱應(yīng)激損傷的發(fā)生,熱休克蛋白表達(dá)的響應(yīng)情況尚有待于進(jìn)一步揭示。

隨著飼養(yǎng)方式由放養(yǎng)型向集約化、高密度飼養(yǎng)的轉(zhuǎn)變,原本很少出現(xiàn)熱應(yīng)激的水禽也受到了熱應(yīng)激的威脅,而且水禽與陸生家禽存在著明顯的生態(tài)適應(yīng)性差異,揭示水禽器宮組織中熱休克蛋白隨熱應(yīng)激強(qiáng)度變化的表達(dá)規(guī)律,對(duì)于深入探討家禽的熱應(yīng)激耐受機(jī)制具有重要意義。本研究以鵝為研究對(duì)象,對(duì)急性熱應(yīng)激條件下鵝主要組織中HSP70 mRNA及蛋白的表達(dá),尤其是其隨熱應(yīng)激強(qiáng)度的變化規(guī)律進(jìn)行研究,以期為深入探討HSP70在家禽抵抗應(yīng)激性損傷中的生理功能和作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)選取1日齡健康雁鵝60只,隨機(jī)分成6組,每組10個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)1只,單籠飼養(yǎng)在環(huán)控倉(cāng)內(nèi),自由采食及飲水。隨著日齡的增長(zhǎng),逐漸將環(huán)境溫度下調(diào)至(22±1)℃。待飼養(yǎng)至8周齡時(shí),A組環(huán)境溫度仍設(shè)置(22±1)℃,B、C、D、E、F組鵝分別施于2、4、6、8 h和10 h(40±1)℃(相對(duì)濕度65%)的高溫處理,各組處理均在16∶00結(jié)束。

1.2 樣品采集試驗(yàn)處理結(jié)束后,試驗(yàn)鵝全部屠宰,取心、肝、肺和腎臟組織樣本,一部分固定于4%多聚甲醛溶液中以備免疫組織化學(xué)檢測(cè)；另一部分迅速投入液氮速凍后置-80℃保存待測(cè)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 鵝體組織中HSP70mRNA定量檢測(cè)總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄：利用Trizol試劑盒提取總RNA,凝膠電泳以及核酸蛋白儀鑒定其純度和完整性,OD260/OD280為1.8～2.0,使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(寶生物工程有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,-20℃保存。

引物設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBank發(fā)表的鵝HSP70基因序列(序列號(hào)：EU680475)和GAPDH基因序列(序列號(hào)：DQ821717),利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)引物,HSP70 F：5′-GGAGACAAGTCCGAGAAT-3′, HSP70R：5′-GGAGGGATGCCTGTTAGA-3′；GAPDHF：5′-GGTGGTGCTAAGCGTGTCAT-3′,GAPDH-R：5′-CCCTCCACAATGCCAAAGTT-3′。所有引物均由上海生工生物技術(shù)公司合成。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：熒光實(shí)時(shí)定量PCR在美國(guó)產(chǎn)ABI7000熒光定量分析儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為20 μL,反應(yīng)液配比為cDNA模板1.0 μL,上、下游引物各0.4 μL,Premix Ex Taq10 μL,滅菌蒸餾水7.8 μL,ROX Reference Dye(50×)0.4 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s,95℃5 s,60℃30 s,共40個(gè)循環(huán)。所有樣品檢測(cè)均設(shè)1個(gè)平行樣和1個(gè)無(wú)模板的阱性對(duì)照以排除假陽(yáng)性結(jié)果。獲得HSP70標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=-3.5846Log(X)+27.2794,相關(guān)系數(shù)為R2=0.9693；內(nèi)參GAPDH標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=-3.5086Log(X)+23.8604,相關(guān)系數(shù)為R2=0.9679?！鰿t(CtHSP70-CtGAPDH)與模板倍比稀釋濃度的線(xiàn)性方程為Y=0.018X+3.406,斜率接近0,說(shuō)明HSP70 mRNA和內(nèi)參GAPDH具有相似的擴(kuò)增效率,可以應(yīng)用2-△△Ct法對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算分析。

1.3.2 鵝體組織中HSP70含量檢測(cè)組織切片的制備：按常規(guī)組織學(xué)方法,將多聚甲醛固定的心臟組織樣修樣,經(jīng)過(guò)水洗、脫水和透明處理后進(jìn)行石蠟包埋,制成臘塊,5 μm切片,H.E染色,光鏡下觀(guān)察并拍照。

免疫組織化學(xué)染色：組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后置于pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液中修復(fù)5 min；經(jīng)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑孵育10 min；5%山羊血清封閉10 min；一抗(HSP 70單克隆抗體) 37℃孵育1 h；生物素標(biāo)記的二抗孵育10 min；鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液孵育10 min；DAB顯色3 min；蘇木精復(fù)染8 min；脫水、透明、中性樹(shù)膠封固,光鏡下觀(guān)察并拍照。HSP70陽(yáng)性染色呈棕黃色。

圖像采集與分析：用Olympus攝影顯微鏡進(jìn)行圖像采集,用Image-pro Plus5.02進(jìn)行圖像分析。每個(gè)觀(guān)測(cè)樣本選取5個(gè)視野進(jìn)行照相,計(jì)算其平均數(shù),為該張切片的測(cè)試值。以積累光密度值(IOD)表示HSP70的相對(duì)含量。

其中,αi每塊免疫組化染色陽(yáng)性區(qū)域的面積；βi該陽(yáng)性區(qū)域的光密度；n 陽(yáng)性區(qū)域的數(shù)目。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件的One-Way程序,針對(duì)不同器宮HSP70及其mRNA隨熱應(yīng)激處理時(shí)間延續(xù)的表達(dá)規(guī)律,遵循Yij=Ai+eij模型(i代表熱應(yīng)激處理時(shí)間,j代表重復(fù))進(jìn)行方差分析(LSD)和趨勢(shì)分析,結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組織HSP70mRNA表達(dá)量變化如表1所示,心臟中HSP70 mRNA表達(dá)水平隨熱應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng),遵循二次曲線(xiàn)回歸模式(P=0.004),HSP70 mRNA表達(dá)水平從熱應(yīng)激2 h開(kāi)始顯著升高(P＜0.05),4 h熱應(yīng)激處理后達(dá)到最高水平,但隨著熱應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng),熱應(yīng)激8、10 h后HSP70 mRNA表達(dá)水平并未再持續(xù)升高,反而降低至對(duì)照組水平；肝臟的HSP70 mRNA水平在熱應(yīng)激4 h后達(dá)到峰值(P＜0.05),此后的6、8、10 h HSP70 mRNA水平雖絕對(duì)值有所下降但仍顯著高于對(duì)照組(P＜0.05),未表現(xiàn)出顯著的線(xiàn)性回歸趨勢(shì)(P=0.054)；鵝肺臟組織HSP70 mRNA水平從熱應(yīng)激2 h開(kāi)始,隨熱應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)顯著的線(xiàn)性升高趨勢(shì)(P=0.004)；腎臟HSP70 mRNA表達(dá)水平與肺臟相似,從熱應(yīng)激4 h開(kāi)始隨熱應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)線(xiàn)性升高(P=0.027)。

2.2 各組織HSP70表達(dá)量變化如表2所示,熱應(yīng)激處理期間,心肌HSP70含量從熱應(yīng)激2 h后便顯著升高,并于熱應(yīng)激4 h后達(dá)到峰值,此后在熱應(yīng)激8 h和10 h恢復(fù)到熱應(yīng)激前水平,隨熱應(yīng)激時(shí)間延長(zhǎng)的變化規(guī)律遵循二次曲線(xiàn)回歸模式(P=0.006)；肝臟中HSP70的含量隨熱應(yīng)激時(shí)間的變化趨勢(shì)與心肌組織相似,也在熱應(yīng)激4 h時(shí)顯著升高至峰值,但此后各時(shí)間點(diǎn)HSP水平雖逐漸下降,但仍顯著高于對(duì)照組；肺臟組織中HSP70水平隨熱應(yīng)激時(shí)間延長(zhǎng)呈線(xiàn)性升高趨勢(shì),峰值出現(xiàn)在6 h；腎臟與肺臟相似,HSP70含量隨熱應(yīng)激時(shí)間的變化趨勢(shì)也遵循線(xiàn)性回歸模式(P=0.02),熱應(yīng)激4 h后HSP70水平達(dá)到峰值,4、6 h和8 h間無(wú)顯著差異,熱應(yīng)激10 h后顯著下降,但仍高于熱應(yīng)激前水平。

表1 熱應(yīng)激鵝各組織中HSP70mRNA相對(duì)表達(dá)量

表2 急性熱應(yīng)激對(duì)鵝各器官組織中HSP70表達(dá)的影響(積累光密度)

3 討論

3.1 急性熱應(yīng)激對(duì)鵝各組織中HSP70mRNA表達(dá)量的影響本試驗(yàn)的熱應(yīng)激處理使雁鵝心、肝、肺和腎臟中HSP70 mRNA的表達(dá)水平均出現(xiàn)了不同程度的升高,鵝各組織中HSP70 mRNA水平高表達(dá)出現(xiàn)和維持的時(shí)間存在一定差異。心臟和肺臟組織對(duì)熱應(yīng)激的敏感性較高,HSP70 mRNA表達(dá)水平在熱應(yīng)激2 h后即出現(xiàn)了顯著升高,而肝臟和腎臟HSP70 mRNA表達(dá)水平則在熱應(yīng)激4 h后出現(xiàn)高表達(dá)。在對(duì)熱應(yīng)激條件下肉雞HSP 60mRNA、HSP70 mRNA、HSP90 mRNA表達(dá)情況的研究中也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的現(xiàn)象,熱應(yīng)激條件下不同組織HSPs mRNA水平的變化具有時(shí)間特異性［4-6］。

鵝組織中HSP70 mRNA隨熱應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)所表現(xiàn)出的變化規(guī)律也存在著一定的組織差異。總體來(lái)看,隨著熱應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng),組織中HSP70 mRNA水平均呈現(xiàn)波動(dòng)性變化,出現(xiàn)高峰值后會(huì)有一個(gè)表達(dá)水平下降的過(guò)程。HSPs的轉(zhuǎn)錄是由HSFs介導(dǎo)的［9］,在正常生理狀態(tài)下HSFs位于胞漿內(nèi),處于一種無(wú)活性狀態(tài)［10］。但在熱應(yīng)激條件下,HSF與HSE結(jié)合并活化HSPs基因轉(zhuǎn)錄的反式調(diào)控因子以控制HSPs的表達(dá)［11］。隨著HSPs合成的增加,新生的HSPs又與HSF結(jié)合,反饋抑制HSPs的進(jìn)一步合成［12］。本試驗(yàn)所檢測(cè)到的這種HSP 70 mRNA水平的波動(dòng)性變化完全符合這種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。

3.2 急性熱應(yīng)激對(duì)鵝各組織中HSP70表達(dá)的影響HSP70作為機(jī)體內(nèi)的一種重要的非特異性細(xì)胞保護(hù)蛋白,在應(yīng)激狀況下可以增強(qiáng)機(jī)體的應(yīng)激耐受性,提高細(xì)胞生存率。當(dāng)組織受到熱應(yīng)激損傷時(shí),組織中的HSP70的含量升高以保護(hù)組織細(xì)胞［13］。本試驗(yàn)所測(cè)定各組織中的HSP70水平在熱應(yīng)激的刺激下均顯著升高。心臟、肺臟和肝臟是熱應(yīng)激容易損傷的3種組織,熱應(yīng)激處理過(guò)程中HSP70的高表達(dá)說(shuō)明HSP70在這3種組織的抗應(yīng)激中發(fā)揮著重要保護(hù)作用。目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有關(guān)鵝熱應(yīng)激過(guò)程中HSP70變化的相關(guān)報(bào)道,但與國(guó)內(nèi)外針對(duì)肉雞［14］、鼠［15］動(dòng)物的研究結(jié)果存在較大差異,仍有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

本試驗(yàn)所測(cè)定各組織中HSP70水平開(kāi)始出現(xiàn)顯著升高的時(shí)間不同。肝臟、肺臟和腎臟中HSP70均是在熱應(yīng)激持續(xù)4 h后才出現(xiàn)顯著升高,而心臟在熱應(yīng)激2 h后其HSP70水平即已顯著高于對(duì)照組。這在一定程度上說(shuō)明,上述不同組織中HSP70水平對(duì)熱應(yīng)激的敏感性存在差異。石嬌等［16］對(duì)急性熱應(yīng)激肉雞組織中HSP70進(jìn)行了定位。研究提出,HSP70的表達(dá)與其所在組織的血液供應(yīng)有關(guān),熱應(yīng)激時(shí)心肌活動(dòng)增強(qiáng),心肌收縮加速,心臟血流量大,細(xì)胞中會(huì)合成大量HSP70等熱應(yīng)激蛋白以抵抗急性熱應(yīng)激對(duì)肌絲中肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白和肌鈣蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的破壞,并助其恢復(fù)；肝臟中央靜脈周匣血液供應(yīng)豐富,因此肝臟中HSP70的表達(dá)也首先出現(xiàn)在肝中央靜脈周匣,并且其反應(yīng)比肝小葉其他部位要強(qiáng)。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),心臟中HSP70對(duì)熱應(yīng)激的敏感性要高于其他器宮組織。隨著熱應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng),HSP70的表達(dá)并未表現(xiàn)出線(xiàn)性增長(zhǎng)的趨勢(shì)。熱應(yīng)激2 h后心臟組織中HSP70開(kāi)始顯著升高,4 h后顯著高于2 h的水平,此后開(kāi)始下降,直到熱應(yīng)激8 h和10 h后下降到了對(duì)照組水平。由此可見(jiàn),心肌中HSP70水平隨熱應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)波動(dòng)性變化,這與嚴(yán)建燕［4］對(duì)熱應(yīng)激肉雞HSP60研究結(jié)果相似。其他各器宮組織中HSP70隨熱應(yīng)激時(shí)間延長(zhǎng)的變化規(guī)律與也與心臟相似。

3.3 HSP70mRNA及蛋白在鵝體主要組織中表達(dá)的關(guān)系本研究發(fā)現(xiàn),鵝各組織中HSP70水平隨熱應(yīng)激時(shí)間延長(zhǎng)的變化趨勢(shì)與HSP70mRNA表達(dá)的變化趨勢(shì)幾乎完全相同。當(dāng)組織中HSP70mRNA高表達(dá)時(shí),該組織中HSP70含量亦會(huì)隨之升高,這與雷蕾［6］對(duì)熱應(yīng)激肉雞HSP90及其mRNA的表達(dá)規(guī)律的研究結(jié)果相似。熱休克蛋白的表達(dá)調(diào)控包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)水平,HSP70翻譯水平的調(diào)控主要是由HSP70基因及其mRNA的特性所決定的。HSP70基因沒(méi)有內(nèi)含子,這樣細(xì)胞一旦啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄就能產(chǎn)生成熟的mRNA,致使HSP70大量、快速表達(dá)。此外,熱應(yīng)激時(shí),其他正常蛋白的翻譯受到抑制,從而減少了與HSP70 mRNA翻譯的競(jìng)爭(zhēng),也是HSP70大量表達(dá)的原因之一［17］。但隨著熱應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)也出現(xiàn)了HSP70mRNA表達(dá)先降低至對(duì)照組水平而HSP70含量仍顯著高于對(duì)照組的現(xiàn)象。這可能與HSP的負(fù)反饋調(diào)節(jié)有關(guān),即高水平HSP和HSF結(jié)合時(shí)會(huì)抑制HSF活性,從而減少HSF和HSE的特異性結(jié)合,控制熱休克基因的轉(zhuǎn)錄。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)的急性熱應(yīng)激處理使鵝不同組織中HSP70 mRNA及HSP70水平均出現(xiàn)不同程度的升高。各組織中HSP70 mRNA及HSP70表達(dá)量的變化存在時(shí)間特異性,且隨熱應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出不同的回歸模式,相比較而言HSP70水平的變化更加平穩(wěn),且在一些組織中的變化會(huì)滯后于HSP70 mRNA表達(dá)的變化。

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S835.2

A

0258-7033（2015）09-0052-04

2014-07-02；

2015-01-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31372331）；吉林省現(xiàn)代家禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（201229）

孫澤威（1974-），男，吉林長(zhǎng)春人，博士，副教授，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究，E-mail：sunzewei@jlau.edu.cn

*通訊作者：婁玉杰，E-mail：lyjjlau@163.com