趙旺生，羅軍，邱思源，王紫騫

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌712100）

奶山羊催乳素受體基因CDS區(qū)的克隆和序列分析與腺病毒干擾載體的構(gòu)建

趙旺生，羅軍?，邱思源，王紫騫

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌712100）

本文旨在克隆奶山羊催乳素受體（PrlR）基因CDS序列，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建針對(duì)奶山羊PrlR的腺病毒干擾載體，為研究PrlR在奶山羊乳腺乳脂合成代謝中的功能與調(diào)控作用提供有效的RNA干擾工具。首先從西農(nóng)薩能羊乳腺組織RNA中擴(kuò)增得到完整CDS區(qū)序列，其CDS長(zhǎng)為1 746 bp，包含581個(gè)氨基酸序列，GenBank登錄號(hào)為JF966783；測(cè)序后進(jìn)行序列分析和功能預(yù)測(cè)，奶山羊PrlR基因CDS區(qū)與其他反芻動(dòng)物相應(yīng)序列具有較高的同源性，其跨膜區(qū)為第236～258位氨基酸；然后根據(jù)測(cè)序得到的CDS序列，在線設(shè)計(jì)合成奶山羊PrlR的sh RNA序列并成功構(gòu)建重組干擾腺病毒載體；將這些載體在293細(xì)胞系中進(jìn)行包裝和擴(kuò)繁，最終獲取高滴度的腺毒，使用TCID50法檢測(cè)病毒滴度為5.19×108PFU/mL。

催乳素受體；克??；腺病毒；shRNA；奶山羊

山羊奶中乳蛋白、乳脂含量高，且具有脂肪酸不飽和度高、短中鏈脂肪酸含量高等特點(diǎn)，這些特點(diǎn)使得山羊奶成為具有優(yōu)良營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特風(fēng)味的動(dòng)物食品［1-2］。研究山羊乳腺乳脂代謝尤其是乳脂生物合成的調(diào)控機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步了解乳腺泌乳過(guò)程的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，研究利用乳腺生物反應(yīng)器都有重要意義。研究表明，催乳素受體在乳脂合成代謝中有重要的調(diào)控作用［3-5］。催乳素受體（prolactin receptor，PrlR）是單次跨膜蛋白，屬于Ⅰ類細(xì)胞因子超家族。乳腺細(xì)胞膜表面的PrlR與其配體結(jié)合后，可開啟細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，與泌乳相關(guān)的下游基因作用，從而增加乳蛋白和乳脂含量，最終促進(jìn)泌乳。PrlR可通過(guò)Ark-1等轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)通路，調(diào)控與乳脂合成相關(guān)基因的表達(dá)［6-8］。自從PrlR第1次被分離克隆后［9］，多個(gè)物種上的PrlR基因的mRNA序列已經(jīng)得到［10-13］。盡管蛋白的基本結(jié)構(gòu)相同，其核苷酸和氨基酸序列在不同物種的長(zhǎng)度和組成都有差異，其在染色體上的定位也各不相同。到目前為止，尚無(wú)完整的山羊PrlR基因CDS序列，對(duì)研究其功能和調(diào)控機(jī)制造成了一定的障礙。本研究以乳腺泌乳調(diào)控中起主要作用的PrlR作為研究對(duì)象，從泌乳盛期乳腺組織中克隆山羊PrlR基因CDS區(qū)序列，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建腺病毒干擾載體，為進(jìn)一步的功能研究提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品實(shí)驗(yàn)羊來(lái)自西北農(nóng)林科技大學(xué)薩能羊原種場(chǎng)，選取健康的純種西農(nóng)薩能羊（第2胎，泌乳52 d），手術(shù)法采集乳腺組織樣。

1.1.2 主要試劑RNA提取試劑盒、cDNA第1鏈合成試劑盒、TOP10感受態(tài)細(xì)胞和DNA凝膠純化回收試劑盒均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；3′RACE試劑盒購(gòu)自大連寶生物（TaKaRa）有限公司；5′RACE試劑盒、TRIZOL購(gòu)自Invitrogen公司；DNA質(zhì)粒提取和凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京博大泰克（BioDev）公司；T4連接酶和pGM-T Easy載體購(gòu)自Promega公司；PCR引物由上海捷瑞有限公司合成，shRNA模板由上海生工公司合成；穿梭載體pENTR/CMV-GFP/ U6質(zhì)粒及腺病毒骨架載體pAd/PL-DEST質(zhì)粒由深圳大學(xué)茍德明教授惠贈(zèng)；293細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)NCBI已公布的綿羊PrlR基因CDS序列和牛PrlR基因cDNA序列設(shè)計(jì)合成PrlR克隆引物PrlR-U1和PrlR-L1，最終得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1 463 bp，擴(kuò)增PrlR上、下游CDS區(qū)序列所用引物參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行設(shè)計(jì)。

根據(jù)克隆得到的西農(nóng)薩能羊PrlR序列，利用siRNA在線設(shè)計(jì)程序（http：//jura.wi.mit.edu/bioc/ siRNAext/home.php）設(shè)計(jì)PrlR的siRNA序列。通過(guò)序列比對(duì)分析，篩選針對(duì)奶山羊長(zhǎng)型PrlR mRNA胞內(nèi)區(qū)的siRNA。在siRNA基礎(chǔ)上，添加發(fā)夾環(huán)序列間隔（GAGTACTG），BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，和TTTTTT終止信號(hào)，即得到編碼目的基因shRNA的單鏈DNA寡核苷酸正、反義鏈模板。

1.2.2 奶山羊PrlR基因CDS克隆采用Trizol法提取西農(nóng)薩能羊乳腺組織總RNA。利用引物PrlR-U1和PrlR-L1擴(kuò)增得到奶山羊PrlR基因的部分CDS區(qū)片段。利用引物PrlR-3I1和PrlR-5I3進(jìn)行RACE PCR擴(kuò)增得到奶山羊PrlR基因的上、游CDS區(qū)片段。將目的片段切膠回收純化，連接T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽(yáng)性單克隆提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確后進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析采用NCBI中的nucleotide blast程序（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對(duì)測(cè)序獲得的PrlR基因核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)和分析；利用BioXM 2.6軟件對(duì)PrlR基因的蛋白質(zhì)分子量及等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)以及不同物種間氨基酸序列的比對(duì)；利用ExPASy網(wǎng)站的ProtScale程序（http：//web. expasy.org/protscale/）對(duì)PrlR的氨基酸序列進(jìn)行疏水性預(yù)測(cè)；通過(guò)CBS Prediction Servers（http：//www.cbs. dtu.dk/services/）中的SignalP和TMHMM程序分別對(duì)PrlR的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)和跨膜區(qū)域進(jìn)行分析。

1.2.4 重組腺病毒載體的構(gòu)建將合成的單鏈shRNA稀釋后進(jìn)行退火，得到雙鏈寡核苷酸序列，稀釋到工作濃度后與BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切的穿梭載體pENTR/CMV-GFP/U6進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)TOP10，卡那霉素抗性篩選后，提取陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序。將帶有shRNA序列的穿梭載體與骨架載體pAd/PL-DEST進(jìn)行同源重組，酶切鑒定正確后測(cè)序。重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞。

1.2.5 腺病毒的包裝與擴(kuò)增重組腺病毒載體經(jīng)PacⅠ酶切線性化，純化回收后用于轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)融合度為80%～90%的293細(xì)胞系。在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的多少，以顯示腺病毒的包裝與擴(kuò)繁程度。當(dāng)約50%細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底部脫落時(shí)即可收毒。重復(fù)“感染-凍融-收集”，大量擴(kuò)增重組腺病毒。

1.2.6 腺病毒滴度的測(cè)定采用TCID50法（50%組織培養(yǎng)感染劑量法）測(cè)定腺病毒滴度。

表1 特異引物的名稱及序列

2 結(jié)果

2.1 奶山羊PrlR基因CDS克隆經(jīng)比對(duì)拼接，得到奶山羊長(zhǎng)型PrlR基因CDS區(qū)序列，全長(zhǎng)1 746 bp，編碼581個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)JF966783。

2.1.1 奶山羊PrlR基因CDS區(qū)的同源性分析BLAST同源性比對(duì)結(jié)果顯示奶山羊（JF966783）與牛（NM_001039726）、綿羊（AF041257.1）、人（AK313270）和小鼠（NM_011169）PrlR基因CDS區(qū)序列的核苷酸同源性分別為95%、97%、81%和80%；氨基酸序列同源性分別為91%、94%、67%和62%，見(jiàn)圖4。

圖1 PrlR基因CDS區(qū)PCR產(chǎn)物

圖2 PrlR基因3′RACE PCR產(chǎn)物

圖3 PrlR基因5′RACE PCR產(chǎn)物

圖4 山羊、牛、綿羊、人和小鼠PrlR氨基酸序列同源性比對(duì)

2.1.2 奶山羊長(zhǎng)型PrlR的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)奶山羊PrlR氨基酸序列前24位為信號(hào)肽（見(jiàn)圖5）。Tmpred跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)共發(fā)現(xiàn)4個(gè)可能的跨膜結(jié)構(gòu)，N端在膜外側(cè)；其中分值最高的是從氨基酸236～258位，方向?yàn)橛赏庀騼?nèi)（見(jiàn)圖6）。肽鏈N端以強(qiáng)疏水性氨基酸開始，大約在230～260位氨基酸處存在1個(gè)強(qiáng)疏水性區(qū)域，與預(yù)測(cè)的最大可能跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域重合（圖7）。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)奶山羊長(zhǎng)型PrlR的立體構(gòu)象是由一個(gè)α-螺旋跨膜區(qū)連接的L形蛋白，胞外區(qū)和胞內(nèi)區(qū)各由反向平行的β折疊片組成，包含一些轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲（圖8）。

2.1.3 奶山羊PrlR的功能預(yù)測(cè)翻譯后修飾預(yù)測(cè)奶山羊長(zhǎng)型PrlR上存在9個(gè)可能的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，其中4個(gè)在胞內(nèi)區(qū)，是啟動(dòng)STAT5信號(hào)傳遞的磷酸化位點(diǎn)。在N端胞外區(qū)有2個(gè)潛在的纖連蛋白Ⅲ型功能域（28～112，127～215）；蛋白上存在4個(gè)潛在的酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，5個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)cAmp/cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，4個(gè)糖基化位點(diǎn)和10個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)。顯示了此蛋白具有活躍的生物學(xué)功能。

奶山羊PrlR是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白，化學(xué)式為C2949H4535N739O878S25，分子量65 u，理論等電點(diǎn)為5.20。

2.2 腺病毒干擾載體的構(gòu)建

2.2.1 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA載體的構(gòu)建測(cè)序結(jié)果表明，載體pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA中插入的序列與所設(shè)計(jì)的shRNA原序列完全一致，證明載體構(gòu)建成功（圖9）。

2.2.2 重組腺病毒載體的構(gòu)建重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)氨芐青霉素/氯霉素雙重篩選，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行電泳檢測(cè)，見(jiàn)圖10。進(jìn)一步用ScaⅠ酶切后，以0.6%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，見(jiàn)圖11。測(cè)序結(jié)果顯示，重組序列與pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA中的shRNA序列完全一致，證明重組腺病毒載體構(gòu)建成功。

圖5 山羊PrlR蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)

圖6 山羊PrlR蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析

圖7 山羊長(zhǎng)型PrlR蛋白疏水結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖8 山羊長(zhǎng)型PrlR的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖9 重組腺病毒的包裝與擴(kuò)增(×100)

圖10 重組腺病毒的包裝與擴(kuò)增(×100)

圖11 重組腺病毒的包裝與擴(kuò)增(×100)

2.2.3 腺病毒的包裝、擴(kuò)增及滴度測(cè)定pAd/PLDEST/CMV-GFP/U6-shRNA重組質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ線性化后，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染12 d后GFP大量表達(dá)，收集病毒，得到第1代病毒原液。以病毒上清反復(fù)感染細(xì)胞3次后，獲得高滴度的腺病毒，經(jīng)TCID50法計(jì)算滴度為5.19×108U/mL（圖10）。

圖12 重組腺病毒的包裝與擴(kuò)增(×100)

3 討論

3.1 奶山羊PrlR長(zhǎng)型CDS的同源性分析本研究首次克隆得到了山羊PrlR基因的CDS區(qū)全長(zhǎng)序列，共1 746 bp，編碼581個(gè)氨基酸殘基。山羊PrlR基因與綿羊和牛的PrlR氨基酸和核苷酸序列長(zhǎng)度一樣，同源性很高（＞95%）；與人和小鼠長(zhǎng)型PrlR的序列同源性較差。這顯示PrlR基因的同源性與物種進(jìn)化親緣關(guān)系相關(guān)。山羊長(zhǎng)型PrlR與綿羊的序列相似度最高，此前的報(bào)道顯示，綿羊催乳素能夠用于山羊的體外研究［14］，這2個(gè)物種間序列的高相似性間接提供了理論依據(jù)，因?yàn)橄嗨频氖荏w能夠結(jié)合相似的配體。整體來(lái)看，PrlR基因不同物種間的相似性可以用于預(yù)測(cè)物種進(jìn)化的根據(jù)。奶山羊長(zhǎng)型PrlR上存在9個(gè)可能的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)可能與JAK-STAT5和AKT通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活有關(guān)。

3.2 奶山羊長(zhǎng)型PrlR的跨膜結(jié)構(gòu)SignalP 3.0 Server分析山羊PrlR氨基酸序列N端有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)存在的可能性為0.924，長(zhǎng)度為24個(gè)氨基酸。TMpred跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)奶山羊PrlR基因的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，PrlR基因有4個(gè)可能的跨膜區(qū)域，分別位于第8～12、98～119、236～258和433～454位氨基酸之間，其中氨基酸236～258位的跨膜結(jié)構(gòu)分值高于另外3個(gè)結(jié)構(gòu)的得分總和，其長(zhǎng)度包含23個(gè)氨基酸序列，跨膜方向從膜外到膜內(nèi)，這與已知的PrlR結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是相符的，初步判斷此處為奶山羊長(zhǎng)型PrlR蛋白的跨膜區(qū)。與傅澤紅等［15］在人，牛和小鼠上的報(bào)道一致。序列分析表明，此段氨基酸序列與牛和綿羊的相應(yīng)序列完全一致，保守性極高。相同區(qū)段有較強(qiáng)的疏水性；3級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)此處為一個(gè)α-螺旋。這些結(jié)果符合此處為跨膜區(qū)的判斷。另外，在這段區(qū)域的上游緊鄰的氨基酸第215～219位，發(fā)現(xiàn)了催乳素受體胞外域近膜處的特征性“WS結(jié)構(gòu)”（WSEWS）［4］，進(jìn)一步驗(yàn)證了此處為蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)。據(jù)此得出奶山羊PrlR的ECD長(zhǎng)235個(gè)氨基酸，ICD長(zhǎng)323個(gè)氨基酸。同時(shí)PrlR的3級(jí)結(jié)構(gòu)的膜外區(qū)有7條β折疊股組成一個(gè)三明治結(jié)構(gòu)，其他為轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲，與在人上關(guān)于PrlR的3級(jí)結(jié)構(gòu)的報(bào)道一致［16］。

3.3 shRNA的設(shè)計(jì)小發(fā)夾RNA編碼序列的設(shè)計(jì)，是影響RNA干擾效果的前提條件。本研究利用NCBI的在線BLAST進(jìn)行初篩，得到了針對(duì)PrlR基因的4對(duì)shRNA，分別在奶山羊PrlR基因編碼區(qū)起始密碼子（ATG）后不同范圍（393、70、860、1156）的19 bp序列。通過(guò)對(duì)綿羊和牛的長(zhǎng)短型PrlR的CDS序列發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)型受體比短型受體多一個(gè)胞內(nèi)區(qū)。因此本研究選擇位于胞內(nèi)區(qū)的shRNA-1106，用于構(gòu)建腺病毒載體以保證其能特異性地位于長(zhǎng)型PrlR基因的CDS區(qū)，從而避免對(duì)其他類型PrlR的作用。

4 結(jié)論

奶山羊PrlR基因CDS區(qū)全長(zhǎng)1746 bp，編碼581個(gè)氨基酸殘基，與反芻動(dòng)物相應(yīng)序列的同源性較高。奶山羊PrlR基因?yàn)閱未慰缒さ鞍祝缒^(qū)域在236～258個(gè)氨基酸，含有催乳素受體蛋白的典型特征和多個(gè)潛在的功能位點(diǎn)。

本研究成功構(gòu)建了奶山羊PrlR基因的介導(dǎo)shRNA的腺病毒載體，然后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞系進(jìn)行腺病毒的包裝和擴(kuò)繁，最終獲得了高滴度的腺病毒原液，從而為下一步在奶山羊乳腺細(xì)胞上研究PrlR基因?qū)θ橹恼{(diào)控提供基礎(chǔ)。

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Cloning，Sequence Analysis of PrlR CDS and Construction of Adenovirus Vector for RNA Interference in Dairy Goat

ZHAO Wang-sheng,LUO Jun*,QIU Si-yuan,WANG Zi-qian
（College of Animal Science and Technology,Northwest A&F University,Shanxi Yangling 712100,China）

To provide effective tool to study the role of PrlR in regulation of milk fat synthesis in mammary gland,the present study cloned the coding regions（CDS）of PrlR from mammary gland of Xinong Saanen goat and constructed RNA interfering adenovirus vectors targeting goat PrlR upon CDS sequence.First,complete CDS sequence was amplified from extracted RNA in mammary gland of Xinong Saanen goat and PrlR CDS（GenBank No.JF966783）is 1746 bp in length,coding 581 amino acid residues；Sequence analysis and functional prediction was performed after sequencing and found there was high homologies among goats and some other ruminants and the transmembrane region of PrlR locates at 236～258 amino acid residues；Then,shRNA sequences of PrlR gene was designed online and recombinant adenovirus vectors carrying shRNA targeting goat PrlR was successfully constructed according to the CDS sequences from sequencing；Finally,these adenovirus vectors were packaged and amplified in 293 cell line and hightitered adenovirus（5.19×108 PFU/mL）was obtained after multiple infection with TCID50 method.

dairy goat；PrlR；cloning；adenovirus；shRNA

S827.2

A

0258-7033（2015）09-0056-06

2014-05-24；

2014-11-12

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（2014ZX08009-051B）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201103038）

趙旺生（1983-），男，河南焦作人，博士研究生，主要從事奶山羊乳脂代謝相關(guān)研究，E-mail：genetics@nwsuaf.edu.cn

*通訊作者：羅軍，E-mail：luojun1@yahoo.com