李曉巖

(廣州市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東廣州510180)

BMPs調(diào)節(jié)多種細(xì)胞增殖、分化、凋亡。細(xì)胞外調(diào)節(jié)BMPs的結(jié)合蛋白，表達(dá)能夠被精確地調(diào)節(jié)，可以準(zhǔn)確地限定BMP的功能，被看做為BMP內(nèi)源性拮抗蛋白，他們是一些分泌型多肽(如Follistation、Gremlin、Chordin、Noggin 等)。 其中，Gremlin 是 28-kDa的蛋白，能夠結(jié)合 BMP4，抑制其與受體結(jié)合[1]。Gremlin缺陷的小鼠腎臟缺如和肺間隔缺陷，出生后即死亡[2]。在纖維變性的肺組織，Gremlin過表達(dá)弱化BMP4信號，損傷上皮修復(fù)，維持TGF-β信號[3]。Gremlin的表達(dá)水平與肺纖維化的嚴(yán)重程度負(fù)相關(guān)[4]。在對低氧的反應(yīng)方面，相對于其他器官，Gremlin基因在鼠類的肺組織中選擇性的表達(dá)上調(diào)。低氧明顯增加Gremlin蛋白的表達(dá)，原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓患者的肺組織Gremlin的表達(dá)也顯著提高[5]。Gremlin促進(jìn)大鼠大動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[6]。Gremlin在低氧性性肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制中的作用尚未闡明，本研究觀察不同低氧時(shí)間小鼠肺組織中Gremlin mRNA的表達(dá)，利用BMP4＋/-C57BL/6J雜合子小鼠肺組織Gremlin mRNA的表達(dá)觀察其與BMP4的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

BMP4＋/＋C57BL/6J純合子小鼠和 BMP4＋/－C57BL/6J雜合子小鼠利用genotyping技術(shù)進(jìn)行基因分型。將生后5周的雄性BMP4＋/＋C57BL/6J純合子小鼠隨機(jī)分為5組(n＝3或4):即正常對照組、低氧1天組、低氧3天組、低氧7天組和低氧21天組。6只雄性BMP4＋/－C57BL/6J雜合子小鼠隨機(jī)分成正常對照組和低氧1天組。將低氧小鼠置于低氧裝置內(nèi)，調(diào)節(jié)箱內(nèi)氧濃度為10%，每天24 h持續(xù)低氧。對照組小鼠除吸入空氣外，其它飼養(yǎng)條件與實(shí)驗(yàn)組相同。

1.2 小鼠肺組織RNA的提取

低氧完成后，麻醉小鼠取出心肺組織，左肺儲存于－80℃冰箱備用，右肺組織提取總RNA，肺組織100 mg加入1ml TRIzol(美國Promega)，利用勻漿儀將組織徹底打碎，放置5 min；加0.2 mL氯仿劇烈震蕩離心管15 s，放置2－3 min；4 ℃下12 000 ×g離心15 min后轉(zhuǎn)移水相到新的離心管中，加入0.5 mL的異丙醇沉淀RNA，放置10 min后4℃，12 000×g離心10 min。RNA在管底和側(cè)面形成膠樣片狀沉淀，移去上清加入1 mL 75%酒精洗滌RNA，渦旋混合物4°C，7，500×g離心 5 min；短暫干燥 RNA 膠樣片狀沉淀，用 RNase-free水溶解RNA(DNA-freeTMkit:Applied Biosystems公司)

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Gremlin mRNA的測定

Primer3軟件設(shè)計(jì) Gremlin的引物序列，mGremlin1L 引物 5′GACAAGGCTCAGCACAATGA 3′； mGremlin1R 引 物 5′ACTCAAGCACCTCCT CTCCA-3′利用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成第一條cDNA(Bio-Rad Laboratories，Carlsbad，CA)，利用 iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad Laboratories)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，Gremlin mRNA擴(kuò)增值利用Pfaf方法計(jì)算[7]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示。用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較用方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測低氧對Gremlin mRNA的表達(dá)

以MCPB為內(nèi)參照，F(xiàn)Q-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率為98.5%，相關(guān)系數(shù)為0.992，融解曲線只有單峰出現(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(＞0.985)及擴(kuò)增效率(90%－120%)判斷所得數(shù)據(jù)的可信。Gremlin mRNA的表達(dá)隨小鼠缺氧的時(shí)間呈先上升后下降的趨勢，低氧第一天，低氧第三天，低氧第七天表達(dá)分別增加2.8倍、1.9倍、2.2倍(P＜0.05)，低氧 21天時(shí)，Gremlin的表達(dá)明顯低于正常氧組，僅有其的1/4(P＜0.05)見表1，圖 1。

表1 低氧對拮抗蛋白Gremlin mRNA表達(dá)的影響(±s)

表1 低氧對拮抗蛋白Gremlin mRNA表達(dá)的影響(±s)

注:與正常組比較，?P＜0.05

Nor(n＝3) 1±0 Hy 1 d(n＝3) 2.8±0.3?Hy 3 d(n＝3) 1.9±0.19?Hy 7 d(n＝4) 2.2±0.49 Hy 21 d(n＝3) 0.26±0.23?

圖1 低氧對Gremllin mRNA表達(dá)的影響

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

正常氧狀態(tài)下，BMP4＋/＋C57BL/6J純合子小鼠和 BMP4＋/-C57BL/6J雜合子小鼠肺組織內(nèi)Gremlin mRNA的表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)。BMP4＋/-C57BL/6J雜合子小鼠常氧1天組Gremlin mRNA相對表達(dá)量為(0.92±0.06)和低氧1天組Gremlin mRNA相對表達(dá)量為(1.04±0.34)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2，圖2。

表2 BMP4＋/＋C57BL/6J純合子小鼠和BMP4＋/-C57BL/6J雜合子小鼠肺組織內(nèi)Gremlin mRNA表達(dá)情況(±s)

表2 BMP4＋/＋C57BL/6J純合子小鼠和BMP4＋/-C57BL/6J雜合子小鼠肺組織內(nèi)Gremlin mRNA表達(dá)情況(±s)

注:與雜合子正常氧組比較，?P＜0.05

純合子正常氧 1±0雜合子正常氧 0.92±0.06雜合子低氧一天 (1.04±0.34)?

圖2 BMP4＋/＋C57BL/6J純合子小鼠和BMP4＋/-C57BL/6J雜合子小鼠肺組織內(nèi)Gremlin mRNA表達(dá)

3 討 論

BMPs內(nèi)源性拮抗蛋白可調(diào)節(jié)BMPs信號系統(tǒng)，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞增殖、分化和凋亡[7，8]。Gremlin作為BMPs內(nèi)源性拮抗蛋白可與BMP4綁定，阻斷BMP4與受體的相結(jié)合從而影響 BMPs信號系統(tǒng)[9]。BMP4和Gremlin在組織中表達(dá)的平衡狀態(tài)決定了BMP4信號通路的水平和細(xì)胞的周期。Gremlin過表達(dá)增加了動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，在血管損傷的病理生理機(jī)制方面也具有重要的作用。

在我們的研究中，選用了BMP4＋/＋C57BL/6J純合子小鼠和BMP4＋/-C57BL/6J雜合子小鼠作為動(dòng)物模型，研究在不同低氧時(shí)間下肺組織內(nèi)Gremlin的mRNA表達(dá)變化。在肺組織中Gremlin mRNA隨低氧時(shí)間發(fā)生變化，這說明在肺組織中Gremlin的mRNA表達(dá)與低氧確實(shí)具有相關(guān)性。在我們的實(shí)驗(yàn)中，低氧21天時(shí)，Gremlin的mRNA表達(dá)甚至低于基線，然而，一些研究表明低氧21天時(shí)BMP4的表達(dá)達(dá)到高峰，35天才逐漸下調(diào)[10]，同時(shí)，正常氧條件下及低氧一天狀態(tài)下，與BMP4＋/＋C57BL/6J純合子小鼠相比，BMP4＋/-C57BL/6J雜合子小鼠肺組織中Gremlin的mRNA表達(dá)無明顯變化，說明很可能與非BMP4的BMPs內(nèi)源性拮抗蛋白相關(guān)存在相關(guān)性。因此，尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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