劉 笑，侯順超，顧 林(揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225000)

胡椒(Piper nigrum L)，始載于唐朝蘇恭的《唐木草》，又名白川、浮椒，是胡椒科胡椒屬常綠藤本植物［1－2］。原產(chǎn)于印度，被稱為“熱帶香料之王”，西漢時(shí)期傳入我國(《后漢書·天絲傳》)，如今已成為我國海南的特色產(chǎn)業(yè)［3］。根據(jù)果實(shí)的成熟程度胡椒有黑白之分，黑胡椒粒大飽滿、氣味濃烈、色黑皮皺，手感質(zhì)地較白胡椒略輕，但氣味更為辛辣［4］。隨著2003年衛(wèi)生部批準(zhǔn)胡椒油樹脂、胡椒油為食品添加劑新品種［5］，胡椒堿作為胡椒中主要的生物活性物質(zhì)，倍受關(guān)注，近年來成為保健產(chǎn)品開發(fā)的新資源。胡椒堿具有抗炎［6］、抑菌［7］、抗氧化［8］、降血脂［9］等活性，對(duì)抑郁癥［10］、心肌缺血［11］、白癜風(fēng)等色素脫失性皮膚病［12］有一定的療效，更有潛力被開發(fā)為新的抗癌藥物［13－14］。

目前，胡椒堿的提取方法主要有酸水提取法［15］、有機(jī)溶劑浸提法(回流法和索氏提取法)［16］、超聲波輔助法［17］、超臨界流體萃取法［18－19］和微波減壓蒸餾法［20－21］等。由于胡椒堿難溶于水，故酸水提取法提取率低;與傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑萃取法相比，超臨界流體萃取具有快速、高效、樣品用量少、幾乎無溶劑殘留及操作條件溫和的特點(diǎn)，但該法設(shè)備投資大，技術(shù)要求高;微波輔助法簡單可靠，對(duì)于胡椒堿的提取還有待進(jìn)一步深入系統(tǒng)化;而超聲法是目前儀器輔助萃取中最為常用的方法，時(shí)間短、效率高，且溶劑用量少［22］。近年來，采用超聲輔助酶法提取植物中活性成分的研究已有些許成效，國內(nèi)外對(duì)胡椒堿的提取研究也不少，但采用超聲輔助酶法提取胡椒堿的工藝研究尚未報(bào)道。筆者通過研究超聲輔助酶法提取黑胡椒中胡椒堿的影響因素，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝條件，從而提高胡椒堿提取率，更好地開發(fā)胡椒資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑。黑胡椒購于海南儋州市;纖維素酶(30 U/mg)，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;磷酸氫二鈉、檸檬酸，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)品(98%)，天津一方科技有限公司;無水乙醇(分析純)，上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備。數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司;高速萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司;電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;SHZ-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;紫外分光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司;KQ-200KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理［23］。稱取適量黑胡椒置于50℃烘箱中恒溫干燥48 h，粉碎并過100目篩，得到黑胡椒粉備用。

1.2.2 樣品提取及其含量測定。準(zhǔn)確稱取3.000 g黑胡椒粉和一定量酶于250 ml錐形瓶中，加入一定pH的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖溶液60 ml，置于恒溫水浴鍋中浸泡后超聲，提取液抽濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入適量無水乙醇溶解保存;濾渣烘干后于250 ml錐形瓶中，加入60 ml無水乙醇浸泡，暗處靜置1 h，超聲提取后抽濾，得到濾液，將2次濾液合并搖勻，即為胡椒堿提取液，于波長342 nm處測吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出胡椒堿含量，從而得到胡椒堿提取率。

超聲輔助酶法提取胡椒堿的工藝流程如圖1。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。準(zhǔn)確稱取15mg胡椒堿標(biāo)品，無水乙醇定容至100 ml，分別取200、400、600、800、1 000、1 200、1 400 μl于25 ml容量瓶中，無水乙醇定容，得到濃度分別為1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2、8.4 mg/L 的胡椒堿醇溶液，以無水乙醇作參比，于波長342 nm處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。對(duì)酶量、緩沖液pH、超聲時(shí)間及酶解溫度4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察它們對(duì)提取胡椒堿的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)［24］。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以胡椒堿提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)酶量(A)、緩沖液pH(B)、酶解溫度(C)3因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)。各因素水平編碼值見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 酶量對(duì)胡椒堿得率的影響。準(zhǔn)確稱取3.000 g胡椒粉于250 ml錐形瓶中，分別加入 3、6、9、12、15 mg 纖維素酶，60 ml pH 6的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖溶液攪勻，置于40℃恒溫水浴鍋中浸泡后40℃下超聲50 min，抽濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入適量無水乙醇溶解并保存;濾渣烘干后于250 ml錐形瓶中，加入60 ml無水乙醇浸泡，暗處靜置1 h，超聲提取1 h后抽濾，得到濾液，將2次濾液合并搖勻，冷卻后測吸光度，計(jì)算提取率，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

由圖3可以看出，纖維素酶的用量對(duì)胡椒堿提取有一定的影響，隨著酶量的增加，胡椒堿的提取率呈明顯上升趨勢，當(dāng)酶量增至12 mg時(shí)，胡椒堿提取率達(dá)到最大，再增加酶量，提取率顯著降低。這可能是由于體系中底物濃度一定，酶濃度的增大，增加了酶與底物接觸機(jī)會(huì)，同一時(shí)間內(nèi)水解的分子數(shù)不斷增加，致使更多成分分離出來，但是當(dāng)酶濃度升高到一定程度，酶分子過于飽和，一部分酶將沒有機(jī)會(huì)與底物結(jié)合，底物被水解的速度變慢，提取率就下降，因此試驗(yàn)確定酶量為12 mg。

2.1.2 緩沖液pH對(duì)胡椒堿提取率的影響。在纖維素酶用量12mg，超聲時(shí)間50min、酶解溫度40℃的條件下進(jìn)行提取，具體操作同“2.1.1”，考察磷酸氫二鈉 －檸檬酸緩沖液pH(3、4、5、6、7)對(duì)胡椒堿提取率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

由圖4可以看出，隨著緩沖液pH的增大，胡椒堿提取率迅速增加，在pH 4時(shí)達(dá)到最大，此后增大pH，胡椒堿提取率逐漸降低。這可能是由于過高或者過低的pH會(huì)影響酶蛋白構(gòu)象，使酶部分變性或失活，從而影響酶活力。pH為4時(shí)處于最適酸度，酶活性和催化效果最高，提取效果達(dá)到最佳，因此試驗(yàn)選取最適pH為4。

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)胡椒堿提取率的影響。在纖維素酶用量12 mg，緩沖液pH 4、酶解溫度40℃的條件下進(jìn)行提取，具體操作同“2.1.1”，考察超聲時(shí)間(20、35、50、65、80 min)對(duì)胡椒堿提取率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

由圖5可以看出，隨著溫度的升高，胡椒堿提取率也隨之增加，當(dāng)超聲時(shí)間延長至50 min時(shí)，提取率最高，此后趨于平緩，甚至略有減少。這可能是由于長時(shí)間超聲提取會(huì)導(dǎo)致胡椒堿中某些不穩(wěn)定的成分氧化分解，從而造成提取率的下降，且考慮到生產(chǎn)周期，試驗(yàn)確定超聲時(shí)間為50 min。

2.1.4 酶解溫度對(duì)胡椒堿提取率的影響。在纖維素酶用量12 mg，緩沖液pH 4、超聲時(shí)間50 min的條件下進(jìn)行提取，具體操作同“2.1.1”，考察酶解溫度(30、35、40、45、50 ℃)對(duì)胡椒堿提取率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖6。

由圖6可以看出，胡椒堿提取率隨著酶解溫度的升高而增大，溫度達(dá)到40℃后，繼續(xù)升高溫度，并不能明顯提高胡椒堿提取率。這可能是因?yàn)殡S著溫度的升高，酶活性增加，反應(yīng)速度加快，但超過最適溫度后，酶蛋白開始變性，酶的活性受到破壞甚至失活，影響到胡椒堿的提取。故該試驗(yàn)選擇40℃為最佳提取時(shí)間。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 胡椒油樹脂提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取酶量(A)、緩沖液pH(B)和酶解溫度(C)為試驗(yàn)因素，以胡椒堿提取率為響應(yīng)值，超聲時(shí)間50 min，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

利用Design Expert 8.05軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到胡椒堿對(duì)3個(gè)因素的二次多元回歸方程:Y=5.689+0.152 625A+0.086 125B+0.013 25C+0.002 5AB －0.026 75AC+0.044 25BC － 0.380 75A2－ 0.153 25B2－0.059 5C2。

2.2.2 回歸模型的方差分析。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析可得:F模型=52.818 06，P模型=0.000 2＊＊;FA=103.989 9，PA=0.000 2＊＊;FB=33.112 99，PB=0.000 2＊＊;FC=0.783 739，PC=0.416 5;FAB=0.013 951，PAB=0.910 6;FAC=1.597 193，PAC=0.262 0;FBC=4.370 553，PBC=0.090 8;FA2=

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由此可以看出，該模型 P=0.000 2 ＜0.01，高度顯著，失擬誤差P=0.065 9＞0.05，不顯著，說明該模型有效。一次項(xiàng)A、B、C均達(dá)到高度顯著水平;3個(gè)因素交互項(xiàng)都不顯著;二次項(xiàng)A2、B2高度顯著，C2顯著。由3個(gè)影響因素的F值大小可知，3個(gè)因素對(duì)胡椒堿提取率影響大小的排序?yàn)?酶量＞緩沖液pH ＞酶解溫度。同時(shí)，決定系數(shù)R2=0.989 591，表明該方程擬合程度較好，試驗(yàn)誤差較小，可以用來分析和預(yù)測黑胡椒中胡椒堿提取率的變化。

2.2.3 響應(yīng)面分析與工藝優(yōu)化。根據(jù)上述結(jié)果繪制模型方程的響應(yīng)曲面和等高線圖，各因素的交互作用見圖7。由圖7可知，酶量對(duì)胡椒堿提取率的影響最為顯著，其次是緩沖液pH，3個(gè)因素之間交互作用都不顯著。

由響應(yīng)面軟件分析可知，在酶量 12.59 mg，pH 4.31，酶解溫度40.91℃的條件下，胡椒堿提取率最大，可達(dá)5.718 39%。為了驗(yàn)證響應(yīng)面法的可行性，并考慮到實(shí)際操作，在酶量12.6 mg，pH 4.31，酶解溫度 41 ℃，超聲時(shí)間 50 min的條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到提取率的平均值為5.624%，與理論值5.718 39%較接近，可見該模型準(zhǔn)確可靠，利用該模型在實(shí)踐中進(jìn)行預(yù)測是可行的。

3 結(jié)論

超聲輔助酶法提取黑胡椒中胡椒堿，并采用響應(yīng)面法對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化。單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果表明，影響胡椒堿提取率的工藝因素按主次順序排列:酶量＞緩沖液pH＞酶解溫度;超聲輔助酶法提取胡椒堿的最佳工藝參數(shù)為酶量 12.6 mg，pH 4.31，酶解溫度41 ℃，超聲時(shí)間 50 min，此條件下胡椒堿的提取率為5.624%，可為胡椒的深加工提供一些理論依據(jù)。

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