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        代謝組學(xué)方法研究進(jìn)展

        2015-12-22 06:21:02郭盛磊楊玉煥
        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年25期
        關(guān)鍵詞:電離代謝物組學(xué)

        紀(jì) 勇,郭盛磊,楊玉煥*

        (1.東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心,東北油田鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱150040 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江哈爾濱150040)

        代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分,是通過觀察生物體系(細(xì)胞、組織或生物個(gè)體)受外部刺激(如外部環(huán)境因素的變化或某些疾病的出現(xiàn))后其代謝路徑以及相應(yīng)代謝產(chǎn)物與非刺激條件下的變化區(qū)別研究生物體系的一門科學(xué)。代謝組學(xué)主要研究相對(duì)分子量小于1 000 Da的內(nèi)源性小分子物質(zhì)。1999年,Nicholson等[1]首次提出代謝組學(xué)的概念,使用“Metabonomics”一詞,通過對(duì)核磁共振(Nuclear magnetic resonance,NMR)的生物數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析來闡釋病理以及生理上的刺激對(duì)生物體代謝產(chǎn)生的變化。2000年,F(xiàn)iehn等[2]提出“Metabolomics”的概念,認(rèn)為代謝組學(xué)主要進(jìn)行代謝物靶標(biāo)分析、代謝輪廓分析、代謝物定性定量分析、代謝指紋分析4個(gè)層次的分析。

        代謝組學(xué)作為一種研究手段,主要具有如下優(yōu)點(diǎn):①代謝組學(xué)反映生物體在各個(gè)因素綜合作用下的終末效應(yīng),是這些效應(yīng)的綜合體現(xiàn),具有很強(qiáng)的綜合信息優(yōu)勢(shì);②其代謝物種類遠(yuǎn)小于所對(duì)應(yīng)的基因和蛋白質(zhì)數(shù)目,研究相對(duì)簡(jiǎn)單;③基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的微小變化會(huì)在代謝物水平上得到放大,因此更容易檢測(cè);④很多內(nèi)源性小分子化合物的生化代謝途徑已較清楚;⑤許多代謝產(chǎn)物已作為疾病的特異性標(biāo)志物用于臨床診斷。代謝組學(xué)的試驗(yàn)流程通常包括以下階段:①前期試驗(yàn)方案設(shè)計(jì);②樣品的前處理;③儀器進(jìn)樣分析;④數(shù)據(jù)處理與分析;⑤闡釋相關(guān)生物學(xué)意義。

        1 前期試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

        在進(jìn)行樣品前處理之前大都要擬定相關(guān)的試驗(yàn)方案。通過明確試驗(yàn)的研究?jī)?nèi)容、目的、意義來優(yōu)化前期的樣品處理。根據(jù)樣品物種來源(如植物、動(dòng)物、微生物等),需要找到樣品前處理的最優(yōu)方法。例如,在設(shè)計(jì)人源樣本的相關(guān)試驗(yàn)時(shí),需考慮樣本之間的差異因素(如年齡、性別、身體狀況、接觸的外部環(huán)境等)[3]以及相同因素樣本的數(shù)量[4],使得樣本(即試驗(yàn)樣本與對(duì)照樣本)之間具有可對(duì)比性。在設(shè)計(jì)植物樣本前處理時(shí),應(yīng)將植物組織中的細(xì)胞壁充分破碎。同時(shí),細(xì)胞內(nèi)的代謝成分不被破壞。Ducruix等[5]使用Tris和甲醇(含有秋水仙素和腎上腺皮質(zhì)激素)提取液超聲萃取擬南芥的細(xì)胞的代謝產(chǎn)物,在破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的同時(shí),又能有效地提取相應(yīng)的代謝產(chǎn)物。另外,根據(jù)試驗(yàn)樣本基質(zhì)不同(如尿液、血漿、細(xì)胞、組織等),在前處理時(shí)需要考慮不同樣本之間不同的前處理方法,達(dá)到最優(yōu)的試驗(yàn)預(yù)期效果[6]。

        2 樣品前處理

        樣品前處理旨在最大限度地將樣本中的雜質(zhì)(如一些蛋白質(zhì)、糖類、脂肪等)除去,同時(shí)能較完整地保留樣品中的整體代謝產(chǎn)物或特異性的目標(biāo)代謝產(chǎn)物。目前,代謝組學(xué)研究最廣泛的是其在臨床上的應(yīng)用。因此,在處理人的尿液、血漿、細(xì)胞、組織過程中會(huì)有多種提取方法,如處理尿液、血漿一般采用液液萃取法,而細(xì)胞、組織則多采用超聲破碎提取。

        由于液液萃取,不能最大限度地除去樣品雜質(zhì),保留樣本中的相關(guān)代謝物。近些年來,固相萃取(Solid phase extraction,SPE)相關(guān)技術(shù)的出現(xiàn)能更好地去除樣品中的雜質(zhì),保留樣品中的代謝物。Chetwynd等[7]使用SPE來分析人類尿液,在尿液中鑒定出24種代謝產(chǎn)物。使用SPE能更好地降低基質(zhì)效應(yīng),從而提高檢測(cè)靈敏度。

        王亞平[8]在尿液樣品前處理時(shí)對(duì)直接進(jìn)樣分析、液液萃取、沉淀蛋白、固相萃取(SPE)4種前處理方法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。結(jié)果表明,沉淀蛋白和直接分析方法處理后得到的樣品中尿素濃度過高,離子抑制現(xiàn)象較明顯,甚至超過色譜柱容量,導(dǎo)致重現(xiàn)性不好;乙酸乙酯等有機(jī)試劑的萃取方法能夠檢測(cè)到極性小的I相代謝產(chǎn)物,極性大的II相代謝產(chǎn)物則會(huì)丟失;而SPE法能夠同時(shí)檢測(cè)I和II相代謝產(chǎn)物,且離子抑制現(xiàn)象不明顯。綜上所述,SPE法是研究代謝組學(xué)較理想的前處理方法。

        3 儀器進(jìn)樣分析

        目前,代謝組學(xué)主要有液相與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)、氣相與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)、核磁共振技術(shù)(NMR)3種分析平臺(tái)。Web of Science的數(shù)據(jù)顯示,LC-MS是目前最主要的代謝組學(xué)分析平臺(tái),其次為NMR,GC-MS使用相對(duì)較少。3種分析平臺(tái)的特點(diǎn)、局限性見表1。3.1 LC-MS 由于目前代謝組學(xué)的研究大多集中在臨床醫(yī)學(xué)、藥理分析領(lǐng)域,而其試驗(yàn)樣本大多為人體尿液、血漿、細(xì)胞、組織等,這些樣本中的代謝物大都能較好地電離。另外,LC-MS靈敏度較高,檢測(cè)限為ppb(即十億分之一),可用于痕量分析。根據(jù)液相的柱效,可分為HPLC(高效液相色譜)和U(H)PLC(超高效液相色譜)。以Waters公司的ACQUITY UPLC?系統(tǒng)為例,其分析樣本所需時(shí)間為HPLC的1/3,靈敏度提高了4倍,分離度提高了2倍;使用試劑節(jié)省95%。有研究表明,當(dāng)用UPLC-MS和HPLC-MS分析同樣的大鼠尿液時(shí),前者的靈敏度、峰響應(yīng)值以及分離的物質(zhì)種類均優(yōu)于后者,且前者的分析時(shí)間較后者大大縮短,更適用于高通量樣品分析[9]。而且,在代謝組學(xué)樣品分析過程中,可使用填料不同的色譜柱(如 C18,Amid,HILIC,T3,Phenyl等),能更全面地分析樣本中代謝物的差異,從而更方便地找到潛在的生物標(biāo)記物。

        表1 代謝組學(xué)3種主要分析平臺(tái)對(duì)比

        根據(jù)電離方式不同,可分為電噴霧離子源(Electron spray ionization,ESI)和大氣壓化學(xué)電離源(Atmospheric pressure chemical ionization,APCI)2種工作方式的質(zhì)譜。ESI可同時(shí)分析揮發(fā)性和非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物,適用于離子型以及極性化合物的鑒定分析。它靈敏度較高,能分析大分子量的化合物(分子量大于1 000 Da)。APCI相較于ESI基質(zhì)效應(yīng)小,且受流動(dòng)相緩沖鹽影響較小。APCI主要分析非極性以及小分子的化合物(相對(duì)于用ESI電離的化合物而言)。因此,在代謝組學(xué)的研究過程中,可同時(shí)使用不同的電離源,使得樣品中的代謝產(chǎn)物更全面[10]。

        根據(jù)質(zhì)量分析器工作原理,質(zhì)譜主要可分為三重四極桿(Triple quadrupole,TQD)、飛行時(shí)間(Time of flight,TOF)、傅里葉變換離子回旋共振(Fourier transform ion cyclotron resonance,F(xiàn)TICR)以及離子阱(Ion trap)。其中,三重四級(jí)桿質(zhì)譜由于其重現(xiàn)性較好主要用于醫(yī)藥、食品安全、大氣環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域的定量分析,因此它可分析代謝組學(xué)中已知的某些特定的代謝產(chǎn)物在體內(nèi)代謝含量的變化[11];而后3種一般被稱為高分辨質(zhì)譜,主要用于代謝組學(xué)中的定性分析。

        近年來,飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF)與超高效液相色譜(UPLC)串聯(lián)即UPLC-TOF,能更快速、更精確地分析代謝產(chǎn)物。Shi等[12]研究患有阿爾茨海默癥SD大鼠的腦組織樣本,使用UPLC-TOF對(duì)樣本進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)酪氨酸、精氨酸、谷氨酰半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、?;撬岬?0種潛在的生物標(biāo)記物。

        3.2 GC-MS 由于GC-MS在分析樣品時(shí)需要進(jìn)行衍生化處理以及只能分析易揮發(fā)且較穩(wěn)定的物質(zhì),GC-MS的應(yīng)用受到了較大的限制[13]。目前,GC-MS在代謝組學(xué)的研究中大多作為靶向性物質(zhì)的分析,亦或作為非靶向性代謝組學(xué)LCMS的一種補(bǔ)充。

        GC-MS有電子轟擊電離(Electron impact,EI)、正化學(xué)電離(Chemical ionization,CI)、負(fù)化學(xué)電離 (Negative chemical ionization,NCI)3種電離方法,其中前兩者較常用。EI具有非選擇性電離的特點(diǎn),只要樣品氣化都能夠離子化,離子化效率高且碎片較豐富,而豐富的碎片離子能夠提供分子結(jié)構(gòu)的一些重要的官能團(tuán)信息。CI電離產(chǎn)生的碎片較少,但它能產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子(Pseudo-molecular ions,M+1),有利于相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定。NCI主要用于帶電負(fù)性基團(tuán)的化合物如含鹵素的一些化合物[14]。

        GC-MS的質(zhì)量分析器常用的有四級(jí)桿質(zhì)量分析器、離子肼質(zhì)量分析器、飛行時(shí)間質(zhì)量分析器3種。近年全二維氣相色譜(Comprehensive two-dimensional gas chromatography,GC×GC)的發(fā)展與應(yīng)用比傳統(tǒng)一維的氣相色譜更適合分析諸如代謝組學(xué)中成分復(fù)雜的樣品。GC×GC具有分辨率高、峰容量大、靈敏度高、分析時(shí)間短等特點(diǎn)[15]。因此,它與TOF串聯(lián)使用既能精確地分離樣品中的代謝物,又能很好地對(duì)代謝物的相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行精準(zhǔn)測(cè)定。Beckstrom等[16]對(duì)非靈長(zhǎng)類動(dòng)物圍產(chǎn)期窒息個(gè)體的血清樣本(含肝素)進(jìn)行GC×GC-TOFMS分析,發(fā)現(xiàn)10種顯著性的差異代謝物,其中包括一些已知的生物標(biāo)記物如乳酸與肌酸酐以及一些特異的差異代謝物如琥珀酸、蘋果酸、花生四烯酸。這3種酸可以作為潛在的生物標(biāo)記物。Li等[17]分析了Ⅱ型糖尿病患者的血漿樣本,發(fā)現(xiàn)葡萄糖、2-羥基異丁酸、亞油酸、棕櫚酸和磷酸鹽5種潛在的生物標(biāo)記物。

        3.3 NMR核磁共振產(chǎn)生的光譜通過強(qiáng)磁場(chǎng)和射頻(RF)脈沖作用到原子核形成的。對(duì)于原子與任一個(gè)奇數(shù)質(zhì)量數(shù)(如1H、13C等),磁場(chǎng)的存在將導(dǎo)致原子核具有旋轉(zhuǎn)能力,也就是核自旋。射頻能量的吸收會(huì)使原子核從低能量旋轉(zhuǎn)狀態(tài)躍升至高能量狀態(tài),隨后就能檢測(cè)到弛豫過程中所發(fā)射的射線。NMR圖譜(特別是化學(xué)位移)是根據(jù)電子繞原子核運(yùn)行所產(chǎn)生的屏蔽效應(yīng)所做出的。人們通過目標(biāo)質(zhì)子與參照物質(zhì)中相對(duì)應(yīng)的質(zhì)子之間共振頻率的差異(百萬分之一)來確定1H NMR的化學(xué)位移。通常,試驗(yàn)中人們將四甲基硅烷溶液設(shè)置成0 mg/L?;瘜W(xué)位移的變化量一般為:1H在0~10 ppm;13C在0~250 ppm[18]。信號(hào)強(qiáng)度取決于相同原子核的數(shù)量。

        NMR分析樣本時(shí)不具有破壞性,且不需要過多的前處理(可直接進(jìn)樣),因此可較全面地分析樣本成分,不具有偏向性,但其靈敏度較MS低,難以準(zhǔn)確地進(jìn)行定量分析,故而限制其在代謝組學(xué)中的應(yīng)用。目前,NMR只能對(duì)樣品中含量較高的代謝物進(jìn)行定性分析。近年來,NMR作為代謝組學(xué)研究中的重要分析平臺(tái)已被廣泛地應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)診斷中,如腦癌、上皮性卵巢癌、肺癌等癌癥以及阿爾茨海默癥、肌萎縮側(cè)索硬化、精神分裂癥等神經(jīng)性疾病[19]。

        目前,代謝組學(xué)進(jìn)行樣本分析時(shí)多采用3種平臺(tái)同時(shí)分析,從而能更加全面地分析樣品的代謝物組成變化,有利于找到更多的潛在生物標(biāo)記物。

        4 數(shù)據(jù)處理分析

        代謝組學(xué)研究中的數(shù)據(jù)分析包括無監(jiān)督模式識(shí)別方法和有監(jiān)督模式識(shí)別方法,其中無監(jiān)督模式識(shí)別方法主要包括主成分分析(Principal component analysis,PCA)、分層聚類分析(Hierarchical cluster analysis,HCA)等;有監(jiān)督識(shí)別模式方法主要包括偏最小二乘判別分析(Partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA)、正交信號(hào)校正技術(shù)偏最小二乘分析(Orthogonal signal correction partial least squares,OPLS)、正交信號(hào)校正技術(shù)偏最小二乘判別分析(Orthogonal signal correction partial least squares-discriminant analysis,OPLSDA)、隨機(jī)森林分析(Random forests,RF)等。其中,PCA、PLS-DA、OPLS-DA使用最廣泛。

        PCA數(shù)據(jù)處理后生成的圖有兩種,一種為得分圖,另一種為載荷圖。另外,根據(jù)圖形的維度可分為2D圖和3D圖。得分圖反映各個(gè)樣品在空間中的分布情況,可用于觀察樣品的離散情況。樣品點(diǎn)分布越靠近,說明這些樣品的組成接近;樣品點(diǎn)分布越遠(yuǎn),說明樣品間差異越大。PCA中的載荷圖可反映樣品變量分布情況,可利用其識(shí)別樣品間潛在的差異化合物。

        而PLS-DA與OPLS-DA是在明確樣品分類的情況下,使不同類別樣品盡可能地分開,它們的分類效果要比PCA更好。與PLS-DA相比,OPLS-DA既能更有效地消除數(shù)據(jù)集中的干擾信息對(duì)分類判別的影響,又能充分發(fā)揮樣品分類屬性的識(shí)別作用,提高分類能力。當(dāng)獲得分類識(shí)別以后,可使用模型變異權(quán)重系數(shù)(Variable importance for the projection,VIP)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,通過VIP圖來篩選差異化合物(VIP值一般大于1),然后將這些物質(zhì)的譜圖與NIST、Metlin、HMDB等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),進(jìn)而找到潛在的生物標(biāo)記物。

        代謝組學(xué)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析的主要目標(biāo)是簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu),達(dá)到判別分類的目的,從而為尋找代謝差異物提供數(shù)據(jù)依據(jù)。另外,也可以通過建立數(shù)據(jù)處理模型,分析代謝差異物的代謝調(diào)控關(guān)系。代謝組學(xué)基本的數(shù)據(jù)處理流程見圖1。

        代謝組學(xué)研究檢測(cè)到的是海量多維的數(shù)據(jù)。分析這些數(shù)據(jù),需要借助專門的數(shù)理統(tǒng)計(jì)和生物信息學(xué)軟件,從而快速、高效地呈現(xiàn)可視化的分析結(jié)果。目前,代謝組學(xué)常用的軟件可大致分為兩類:一類是開放性軟件,包括MATLAB(Matrix laboratory)、SAS(Statistics analysis system)、SIMCA(Soft independent modeling of class analogy)-P、R 軟件、XCMS等;另一類是儀器自帶軟件,包括 MarkerLynx(Waters)、MassHunter(Agilent)、MarkerView(Applied Biosystems/MDS SCIEX)、Bruker Profile Analysis(Bruker)等。

        5 闡釋生物學(xué)意義

        代謝組學(xué)的最終目標(biāo)就是要找到生物體受到某種外界刺激后產(chǎn)生的代謝途徑變化,即通過生物統(tǒng)計(jì)的方法分析儀器中的數(shù)據(jù),盡可能多地找到生物標(biāo)記物,利用這些標(biāo)記物描繪出這種代謝途徑的變化。目前,代謝組學(xué)主要應(yīng)用于臨床診斷分析上,通過對(duì)一些疾病的生物標(biāo)記物的檢測(cè),既迅速又準(zhǔn)確地診斷疾?。?0]。此外,還可以用于對(duì)臨床上的差異化治療提供依據(jù)[21]。另外,代謝組學(xué)在植物脅迫領(lǐng)域里的應(yīng)用也有較廣泛的應(yīng)用前景[5]。

        6 結(jié)語

        盡管代謝組學(xué)領(lǐng)域中已有許多成果,但目前還有很多問題亟待解決。首先,3種分析平臺(tái)都有分析樣品的局限性,不能較全面地分析樣品內(nèi)代謝物的組成成分,也就不能更客觀地掌握代謝途徑的變化趨勢(shì),因此,需要突破分析平臺(tái)的這種局限性。其次,在數(shù)據(jù)前處理時(shí),在降低背景化學(xué)噪聲、變異校準(zhǔn)、峰匹配的過程中會(huì)出現(xiàn)一些系統(tǒng)性的錯(cuò)誤,導(dǎo)致產(chǎn)生一些人為添加的數(shù)據(jù)信息。最后,在數(shù)據(jù)分析過程中,分析模型具有不確定性,不能較精準(zhǔn)地分析數(shù)據(jù)。這需要我們建立更精確的數(shù)據(jù)分析模型,發(fā)現(xiàn)更多的生物標(biāo)記物。

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