蔡鵬程 魏 燕 胡麗華

（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗科，武漢 430022）

TIM4在過敏性哮喘患者單核細胞和哮喘小鼠模型肺組織表達增高

蔡鵬程 魏 燕 胡麗華*

（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗科，武漢 430022）

目的 探討 T細胞免疫球蛋白粘蛋白域4（T cell immunoglobulin domain and mucindomain 4，TIM4）在過敏性哮喘中的表達及與疾病之間的關(guān)系。方法 隨機選取了30例過敏性哮喘患者和30例健康對照的全血標本，流式細胞術(shù)檢測了 TIM4在單核細胞的表達水平，庫爾特計數(shù)法檢測了嗜酸性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞占白細胞的比例。免疫組織化學(xué)法檢測了哮喘小鼠模型和對照小鼠肺組織 TIM4的表達水平。結(jié)果 哮喘患者組 TIM4陽性細胞占外周血單核細胞的2.51%，顯著高于健康對照組的0.68%；哮喘患者組的嗜酸性粒細胞比例（3.88%）顯著高于健康對照組（1.23%）；但TIM4表達水平與嗜酸性粒細胞，單核細胞與淋巴細胞之間未見相關(guān)性。哮喘小鼠模型氣道上皮細胞TIM4的表達水平高于小鼠對照組。結(jié)論 TIM4在過敏哮喘中的表達水平升高，可能參與了過敏性哮喘的免疫失衡機制。

TIM4；過敏性哮喘；嗜酸性粒細胞；淋巴細胞

過敏性哮喘是一種以氣道高反應(yīng)性為特征的可逆性氣道阻塞性疾病，淋巴細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞等參與了氣道的慢性炎癥。Th1／Th2淋巴細胞的失衡是過敏性哮喘發(fā)病機制的重要環(huán)節(jié)。T細胞免疫球蛋白粘蛋白域4（T cell immunoglobulin domain and mucindomain 4，TIM4）主要表達于巨噬細胞［1］，樹突狀細胞等抗原遞呈細胞表面，與 TIM1結(jié)合后刺激 Th2細胞的活化，促進Th1／Th2平衡向Th2細胞偏移。已有研究表明TIM4表達的升高與胃腸道過敏性疾病的發(fā)病有關(guān)［2］，而 TIM4在過敏性哮喘中的表達水平知之甚少。因此，我們采用流式細胞術(shù)及免疫組織化學(xué)染色分別檢測了哮喘患者外周血單個核細胞及小鼠哮喘模型肺組織 TIM4的表達水平，以明確其在過敏性哮喘發(fā)病機制中的作用。

材料和方法

1.材料

1.1 材料來源

過敏性哮喘患者30例，男16例，女14例，年齡12-60歲，均來自于華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院門診部和住院部。過敏性哮喘診斷標準：（1）反復(fù)發(fā)作喘息、氣急、胸悶或咳嗽，多與接觸變應(yīng)原、冷空氣、物理、化學(xué)性刺激、病毒性上呼吸道感染，運動等有關(guān)。（2）發(fā)作時在雙肺可聞及散在或彌漫性，以呼氣相為主的哮鳴音，呼氣相延長。（3）上述癥狀可經(jīng)治療緩解或自行緩解。（4）除外其它疾病所引起的喘息、氣急、胸悶和咳嗽。（5）臨床表現(xiàn)不典型者應(yīng)至少具備以下一項試驗陽性：①支氣管激發(fā)試驗或運動試驗陽性；②支氣管舒張試驗陽性［一秒鐘用力呼氣容積（FEV1）增加15%以上且 FEV1增加絕對值 ＞200 ml］；③最大呼氣流量（PEF）日內(nèi)變異率或晝夜波動率≥20%。符合1～4條或 4、5條者可以診斷為支氣管哮喘；④最少一種變應(yīng)原特異 IgE陽性或血漿 IgE高于正常參考值。對照組為協(xié)和醫(yī)院體檢中心的健康體檢者30例，男12例，女18例，年齡10－60歲，均排除了心腦血管、肝腎疾病、自身免疫性疾病和變應(yīng)性疾病的癥狀和病史。采集哮喘患者用藥前及健康體檢者抗凝全血標本，12h內(nèi)完成檢測。本研究獲得華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院倫理委員會的批準，所有研究均經(jīng)研究對象知情同意。

1.2 動物模型

用卵清白蛋白（OVA）被動致敏復(fù)制小鼠哮喘模型，1月齡大小 SPF級雄性小鼠，隨機分為正常對照組和哮喘組。于第1天對哮喘組每只左下腹腔注射含1mg Al（OH）3的0.5 ml 2%OVA，正常對照組注射0.5ml生理鹽水。于第9天第二次對哮喘組注射含1mg Al（OH）3的0.5 ml 2%OVA，正常對照組注射0.5ml生理鹽水。于第 14天開始每周 1，3，5哮喘組霧化2%OVA 100 ml，時間30 min；正常對照組霧化等量生理鹽水；兩組每次霧化前左腹腔注射0.2ml生理鹽水。2個月后留取肺組織標本。

2.方法

2.1 流式細胞術(shù)

100μl人外周血加入5μlTIM4抗體，震蕩混勻后避光孵育30min，加500μl紅細胞裂解液，震蕩混勻避光裂解5min，待試管內(nèi)液體變?yōu)榧t色透明即可離心（1500r／min離心5min），輕棄上清后加入500μl PBS緩沖液洗滌一次，振蕩混勻后采用貝克曼流式細胞儀進行檢測，記錄 TIM4陽性細胞的百分比。

2.2 血常規(guī)檢測

用貝克曼血球儀對哮喘患者組與健康對照組的各個標本進行檢測，記錄淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞占白細胞的百分比。

2.3 TIM4表達的免疫組織化學(xué)檢測

小鼠新鮮肺組織標本經(jīng) 10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片后按照說明書操作進行免疫組化染色。經(jīng)脫蠟、脫水及水化后，相繼滴加抗 TIM4抗體、生物素標記的二抗、鏈霉素蛋白 －過氧化物酶溶液及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液。

3.統(tǒng)計學(xué)分析

TIM4百分比、淋巴細胞百分比、單核細胞百分比、嗜酸性粒細胞百分比采用非參數(shù)檢驗（Mann Whitney test），相關(guān) 性分 析用斯 皮爾曼 秩檢 驗（Pearman’s rank test），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.過敏性哮喘患者血 TIM4陽性單個核細胞比例高

過敏性哮喘患者組與健康對照組的年齡及性別構(gòu)成比例差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。過敏性哮喘組全血中 TIM4陽性的單個核細胞占總單個核細胞的2.51%，高于健康對照組的 0.68%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。同時，哮喘組嗜酸性粒細胞百分比亦明顯高于健康對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；而淋巴細胞及單核細胞百分比在兩組間無明顯差異（圖1）。

2.TIM4的表達水平與嗜酸性粒細胞之間不具相關(guān)性

相關(guān)性分析顯示，在過敏性哮喘患者外周血中，單個核細胞TIM4的表達水平與嗜酸性粒細胞百分比之間的相關(guān)系數(shù)為0.373，P值為0.259，兩者不具相關(guān)性。TIM4表達水平與單核細胞百分比，淋巴細胞百分比之間亦無相關(guān)性（表1）。

表1 TIM4表達水平與外周血嗜酸性粒細胞，淋巴細胞和單核細胞的相關(guān)性Table 1 Correlations between TIM4 expression level and percentages of eosinophils，monocytes，lymphocytes in peripheral blood

圖1 過敏性哮喘患者組和健康對照組外周血 TIM4表達水平及嗜酸性粒細胞，單核細胞和淋巴細胞百分比Fig.1 TIM4 expression level and percentages of eosinophils，monocytes，lymphocytes in peripheral blood of atopic asthma patient group and healthy control group

3.小鼠哮喘模型大氣道和中等氣道上皮細胞 TIM4表達增高

為了研究 TIM4在肺部的表達情況，我們建立了OVA被動致敏的小鼠哮喘模型，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)對小鼠肺組織的 TIM4進行了染色，以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。在小鼠哮喘模型中，氣道內(nèi)分泌物增多，平滑肌層增厚，TIM4陽性表達主要集中于氣道的表層，以氣道上皮細胞最為顯著，TIM4的表達分布于胞膜及胞漿，以胞膜更為明顯；同時在肺結(jié)締組織也觀察到一部分表達TIM4的細胞，TIM4的表達亦分布于胞膜及胞漿。與對照組小鼠相比，哮喘模型大氣道和中等氣道上皮細胞 TIM4的表達程度明顯增強；但小氣道上皮細胞 TIM4的表達與對照組差別并不明顯（圖2）。

圖2 小鼠哮喘模型肺組織 TIM4的表達分布。a.對照組大氣道；b.哮喘組大氣道；c.對照組中氣道；d.哮喘組中氣道；e.對照組小氣道；f.哮喘組小氣道；箭頭指示為氣道上皮Fig.2 Expression and distribution of TIM4 in asthmatic mice model.a.Large airway of control group；b.Large airway of asthmatic group；c.Medium airway of control group；d.Medium airway of asthmatic group；e.Small airway of control group；f.Small airway of asthmatic group；The arrow indicates airway epithelium

討 論

TIM基因家族是2001年 McIntire發(fā)現(xiàn)的一個參與了對T細胞免疫功能調(diào)節(jié)的基因家族［3］，其所在區(qū)域5q31-33是哮喘的遺傳易感區(qū)。人類 TIM基因家族包含TIM1，TIM3，TIM4三個分子，主要調(diào)節(jié)Th0細胞向Th1／Th2細胞的分化發(fā)育，調(diào)節(jié)Thl／Th2免疫平衡的偏移，從而影響過敏性哮喘、器官移植免疫耐受等疾病的進展。TIM1高表達于活化的 Th2細胞，TIM4是 TIM1的受體之一，TIM4與 TIM1結(jié)合后促進 Th2細胞的激活［4］。因此，TIM4表達水平的變化很可能影響Th1／Th2淋巴細胞的平衡。已有多文獻報道了 TIM4基因的遺傳變異與過敏性哮喘的發(fā)病存在關(guān)聯(lián)性［5-7］，且 TIM4表達增高可能是食物過敏，過敏性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病因素之一［8-9］。

本研究結(jié)果顯示，過敏性哮喘患者外周血單個核細胞 TIM4陽性率高于健康對照組，提示 TIM4表達的升高可能與哮喘的發(fā)病有關(guān)。研究表明，阻斷樹突狀細胞上 TIM4與 TIM1的相互作用，能抑制Th2細胞的活化，該功能已在過敏性腸炎、腎缺血再灌注損傷中得到證實［10-11］。TIM4表達的升高可激活更多的 TIM1分子，導(dǎo)致 T細胞平衡向 Th2細胞偏移，引發(fā)Th2細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。此外，過敏性哮喘患者嗜酸性粒細胞百分比也高于健康對照，該結(jié)果與馬萍等的報道一致［12］，但淋巴細胞、單核細胞百分比在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。嗜酸性粒細胞主要抑制嗜堿性粒細胞和肥大細胞合成與釋放活性物質(zhì)，吞噬其釋出顆粒，并分泌組胺酶破壞組胺，從而限制過敏反應(yīng)，因此嗜酸性粒細胞水平的增高與是機體應(yīng)對過敏性哮喘的自我保護機制。在哮喘患者中，TIM4表達水平與嗜酸性粒細胞百分比并無相關(guān)性，可能與它們在過敏性哮喘發(fā)病機中不同的作用有關(guān)，提示多種因素參與了對嗜酸性粒細胞水平的調(diào)控。

病毒感染、吸入冷空氣、運動等是哮喘常見的誘發(fā)因素，它們可上調(diào)氣道炎癥的主要細胞—氣道上皮細胞的反應(yīng)性。上皮細胞反應(yīng)性增高表現(xiàn)為通透性增加、炎癥因子的表達分泌增強等，從而引起黏液分泌增多、氣道阻塞及鄰近的支氣管平滑肌痙攣，最后導(dǎo)致哮喘的發(fā)作。此外，因免疫失衡導(dǎo)致哮喘相關(guān)的細胞因子如 IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α等分泌增加，這些細胞因子可作用于局部上皮細胞及免疫細胞，介導(dǎo)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從而改變局部的免疫微環(huán)境參與哮喘長期慢性炎癥的形成。前期研究結(jié)果顯示TIM4可表達于人的氣道上皮細胞株16HBE。為了研究 TIM4在過敏性哮喘中的致病機理，我們建立了小鼠哮喘模型，并用免疫組化的方法對肺部TIM4的表達進行了研究，結(jié)果顯示 TIM4陽性分布區(qū)域包括氣道表層及結(jié)締組織，主要位于氣道表層，其中以氣道上皮細胞表面最為明顯，小鼠哮喘模型的大氣道及中氣道的 TIM4陽性率高于對照組。Backer等在小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)［13］，外來抗原進入呼吸道后被樹突狀細胞轉(zhuǎn)移到縱隔淋巴結(jié)，在淋巴結(jié)髓質(zhì)區(qū)巨噬細胞大量表達 TIM4。當 TIM4敲除后，淋巴結(jié)髓質(zhì)巨噬細胞對抗原特異 T細胞的吞噬減少，降低了呼吸系統(tǒng)的免疫耐受［14］。TIM4可表達于氣道及肺結(jié)締組織內(nèi)的抗原遞呈細胞，如樹突狀細胞，單核細胞表面等，TIM4表達的升高可增強這些細胞的抗原遞呈功能，促進Th2細胞的激活，最終導(dǎo)致過敏性哮喘的發(fā)生。TIM4除了可以與 TIM1結(jié)合，還能與磷脂酰絲氨酸結(jié)合促進細胞對凋亡體的吞噬。位于氣道表層的上皮細胞 TIM4的高表達可增強上皮細胞對凋亡體的吞噬，從而參與局部免疫微環(huán)境及免疫炎癥的調(diào)控。

綜合本研究結(jié)果，在哮喘患者及小鼠哮喘模型中，均觀察到TIM4的表達上調(diào)，位于肺部的樹突狀細胞，巨噬細胞胞膜表面TIM4可與 TIM1結(jié)合促進Th2細胞的活化，導(dǎo)致 T細胞平衡向 Th2細胞偏移，最終導(dǎo)致過敏性哮喘的發(fā)生。而血液中及氣道表層的 TIM4的表達上調(diào)，則可能通過介導(dǎo)單核細胞，上皮細胞等對磷脂酰絲氨酸的吞噬來調(diào)控免疫炎癥，影響相關(guān)細胞的功能的發(fā)揮，如粘液分泌，氣道反應(yīng)增強等來參與哮喘的發(fā)病。因此，TIM4在過敏性哮喘的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用，但鑒于 TIM4生物學(xué)功能的多樣性及免疫微環(huán)境的復(fù)雜性，TIM4在哮喘免疫發(fā)病機制中的具體作用有待進一步深入研究。

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High expression of T cell immunoglobulin domain and mucindomain 4 in monocytes of atopic asthma patients and lung tissue of asthmatic mouse model

Cai Pengcheng，Wei Yan，Hu Lihua*
（Clinical Laboratory Department of Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science＆Technology，Wuhan 430022，China）

Objective To investigate the expression of T cell immunoglobulin domain and mucindomain 4（TIM4）in atopic asthma and the relationship between TIM4 and atopic asthma.Methods The peripheral blood of 30 atopic astnma patients and 30 healthy controls were randomly selected.The expression level of human TIM4 was detected by flow cytometry.The percentages of eosinophils，monocytes and lymphocytes in peripheral blood were measured by Kurt count method.The TIM4 expression level in asthmatic model and control mice was analyzed by immunohistochemistry.Results The percentage of TIM4 positive cells in peripheral blood mononuclear cells of asthmatic patients was 2.51%，significantly higher than in the healthy group（0.68%）.The percentage of eosinophils was also higher in asthmatic patients（3.88%）than in the healthy group（1.23%）.However，there was no correlation between the expression level of TIM4 and the percentages of eosinophils，monocytes or lymphocytes.The TIM4 expression in bronchial airway cells of asthmatic mice was higher than that in control mice.Conclusion The expression of TIM4 is increased in atopic asthma，which indicates that TIM4 may play a role in the immune imbalance mechanism of atopic asthma.

TIM4；Atopic asthma；Eosinophile；Lymphocyte

R562.25

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2015.05.014

2015-06-01

2015-09-11

國家自然科學(xué)基金資助（81200020）

蔡鵬程，男（1982年），漢族，博士研究生

*通訊作者（To whom correspondence should be addressed）：xhhulh＠126.com