張繼太 祝 雪 汪 煥 吳媛媛 彭 飛 張盛周

（安徽師范大學生命科學學院，生物環(huán)境與生態(tài)安全省級重點實驗室，蕪湖 241000）

饑餓與冬眠期牛蛙肝臟糖原含量及主要酶的活性變化

張繼太 祝 雪 汪 煥 吳媛媛 彭 飛 張盛周*

（安徽師范大學生命科學學院，生物環(huán)境與生態(tài)安全省級重點實驗室，蕪湖 241000）

目的 研究饑餓與冬眠期牛蛙肝臟糖原含量和非特異性酯酶（NSE）、堿性磷酸酶（ALP）、過氧化物酶（POX）、琥珀酸脫氫酶（SDH）的活性變化。方法 應用冰凍切片、PAS染色法、酶組織化學技術及光密度定量分析。結果 饑餓期肝糖原含量顯著降低，冬眠期肝糖原含量與活動期無顯著差異；NSE活性在活動期最高，饑餓期顯著降低，冬眠期活性最低；ALP和 POX活性在饑餓期均顯著降低，冬眠期與活動期無顯著差異；SDH活性在饑餓期和冬眠期均顯著降低，活動期活性顯著較高。結論 饑餓和冬眠期牛蛙肝糖原含量變化不一致，其他酶類活性變化相一致，不同時期肝糖原含量和酶活性的變化與牛蛙生理狀態(tài)有著較好的適應性。

牛蛙；肝臟；饑餓；冬眠；組織化學

肝臟不僅為動物體內最大的消化腺，還是重要的代謝器官，其可通過合成與分解肝糖原調節(jié)血糖濃度，通過多種酶的作用參與物質的合成與轉化及解毒等多種代謝活動［1-3］。研究表明，不同生理狀態(tài)下動物肝臟的超微結構、肝糖原含量和各種酶的活性會發(fā)生明顯變化以維持機體的能量平衡和代謝穩(wěn)定［3-7］。

牛蛙（Rana catesbiana）隸屬兩犧綱無尾目蛙科，體大肉肥，為常見的食用蛙類，因其繁殖快、適應性強、生長迅速，抗逆性強且其養(yǎng)殖飼料易取等優(yōu)點，牛蛙的人工養(yǎng)殖在我國得到了大規(guī)模推廣［8］。牛蛙飽食后可耐饑餓，冬季氣溫下降后進入冬眠。目前，有關饑餓與冬眠期牛蛙肝臟糖原含量和酶活性變化方面的研究尚未見報道，本文采用PAS糖原染色法和酶組織化學技術對饑餓與冬眠期牛蛙肝臟糖原含量及非特異性酯酶（NSE）、堿性磷酸酶（ALP）、過氧化物酶（POX）、琥珀酸脫氫酶（SDH）等4種酶的活性變化進行了研究，旨在增進對不同生理狀態(tài)下牛蛙肝臟生理機能的認識，為牛蛙的人工養(yǎng)殖提供基礎資料。

材料和方法

1.實驗材料

成體牛蛙購自蕪湖黃山西路菜市場。9月份取活動期飽食牛蛙 12只，隨機選取 6只穿刺毀髓，迅速解剖，取出肝臟置于 －70℃?zhèn)溆?，?只放入長寬高分別為 100、50和50 cm玻璃飼養(yǎng)箱中，用紗布覆蓋容器上口，饑餓10 d，穿刺毀髓，解剖，取出肝臟置于 －70℃?zhèn)溆谩?2月份取源自與活動期同一養(yǎng)殖場冬眠期成體牛蛙6只，實驗室繼續(xù)冬眠 15 d，穿刺毀髓，解剖，取出肝臟。將肝臟切成約0.5 cm×0.5 cm ×0.5 cm的小塊，放在組織支撐器上，滴加冷凍包埋劑后放入冰凍切片機中低溫固化后切片，切片厚5 μm。

2.組織化學方法

肝糖原檢測采用 PAS染色法，參考張繼太等［9］的方法進行；酶組織化學染色參考韋金鑫等［8］的方法進行，略有改動。

2.1 PAS染色法

冰凍切片入0.5%高碘酸氧化約7 min，流水沖洗5 min后再用蒸餾水浸洗2－3次；冰箱取出無色品紅待至室溫后避光染色15－20 min；用0.5%的偏重亞硫酸鈉漂洗兩次，每次約1 min，蒸餾水洗后蘇木精復染1 min，流水沖洗，蒸餾水浸洗。

2.2 非特異性酯酶（NSE）

NSE作用液成分為 10mg α-醋酸鈉酯、0.4ml丙酮、40 μl 0.1mol／L PBS（pH 7.4）、2.4 ml六偶氮化副品紅，混合后用 2mol／L NaOH溶液調 pH至5.8，此溶液在 30min內使用。將作用液滴加在組織冰凍切片材料上，室溫下反應 10min，蒸餾水浸洗。

2.3 堿性磷酸酶（ALP）

ALP作用液成分為 0.1mol／L堿性磷酸酶緩沖液1.5ml、5%硝基藍四唑（NBT）溶液15 μl和5% 5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽（BCIP）溶液7.5 μl，混勻后需在30 min內使用。將作用液滴加在冰凍切片材料上顯色20min，蒸餾水浸洗。

2.4 過氧化物酶（POX）

POX作用液成分0.06mol／L 3，3-二氨基聯苯胺（DAB）溶液 50μl、3.6%H2O210μl、0.1mol／L Tris-HCl（pH 7.6）緩沖液1.0ml。將混合后的作用液滴加在冰凍切片上，于37℃恒溫箱中反應20 min，蒸餾水浸洗。

2.5 琥珀酸脫氫酶（SDH）

SDH作用液成分為5%硝基藍四唑（NBT）溶液15 μl、0.1mol／L PBS（pH 7.4）1.5ml、30mg琥珀酸鈉鹽，將混勻后的作用液滴加在冰凍切片上，室溫顯色45min，蒸餾水浸洗。

3.光密度測定與數據統(tǒng)計分析

在Olympus BX61型顯微鏡下觀察并拍照，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件對染色陽性部位進行光密度分析，測出切片中陽性部位的累積光密度（integrated optical density，IOD）和面積，算出平均光密度（mean optical density，MOD）。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行差異顯著性比較，P＜0.05為差異顯著。

結 果

光鏡下，牛蛙肝糖原及4種酶在肝組織中均呈現明顯的組織化學顏色反應，經光密度定量分析后，不同時期牛蛙肝臟糖原含量及非特異性酯酶（NSE）、堿性磷酸酶（ALP）、過氧化物酶（POX）、琥珀酸脫氫酶（SDH）的活性變化見表1。

表1 不同時期牛蛙肝臟糖原含量及4種酶的活性變化Table 1 The changes of the glycogen content and activities of four kinds of enzymes in the liver of bullfrog during different periods

1.肝糖原

染色后肝糖原呈紅色或紫紅色（圖1－圖3），主要位于細胞質內，成顆粒狀分布?；顒悠谔窃匡@著較高（P＜0.05），顆粒較大且分布較均勻，冬眠期肝糖原含量與活動期差異不顯著（P＞0.05），饑餓期肝糖原含量顯著降低（P＜0.05），顆粒較小且分布不均勻。

2.非特異性酯酶（NSE）

NSE活性部位呈棕褐色（圖4－圖6），主要位于肝臟細胞的胞質內，活動期酶活性最高（P＜0.05），陽性部位呈較大顆粒狀且在肝組織中均勻分布，饑餓期酶活性顯著降低（P＜0.05），冬眠期酶活性最低（P＜0.05），陽性部位顆粒狀較小且分布不均勻。

3.堿性磷酸酶 （ALP）

ALP活性部位為藍紫色（圖7－圖9），主要位于細胞膜上，活動期酶活性顯著較高，酶顆粒較大且較為密集，饑餓期酶活性顯著降低（P＜0.05），酶顆粒較小且較為疏散，冬眠期酶活性略有降低，但與活動期無顯著差異（P＞0.05）。

4.過氧化物酶 （POX）

POX活性部位呈棕黃色（圖10－圖12），主要位于肝細胞的胞質內且呈較大顆粒狀分布，不同生理時期顆粒大小無明顯差別，但顏色深淺不同，饑餓期酶活性顯著降低，顏色較淺，冬眠期和活動期酶活性顯著較高（P＜0.05），顏色較深，二者間酶活性無顯著差異（P＞0.05）。

5.琥珀酸脫氫酶（SDH）

圖1 活動期肝臟糖原；圖2 冬眠期肝臟糖原；圖3 饑餓期肝臟糖原；圖 4 活動期非特異性酯酶；圖5 冬眠期非特異性酯酶；圖6 饑餓期非特異性酯酶；圖7 活動期堿性磷酸酶；圖8 冬眠期堿性磷酸酶；圖9 饑餓期堿性磷酸酶；圖10 活動期過氧化物酶；圖11 冬眠期過氧化物酶；圖12 饑餓期過氧化物酶；圖13 活動期琥珀酸脫氫酶；圖 14 冬眠期琥珀酸脫氫酶；圖15 饑餓期琥珀酸脫氫酶；標尺：50μmFig.1 liver glycogen during active period；Fig.2 liver glycogen during hibernation；Fig.3 liver glycogen during starvation；Fig.4 NSE during active period；Fig.5 NSE during hibernation；Fig.6 NSE during starvation；Fig.7 ALP during active period；Fig.8 ALP during hibernation；Fig.9 ALP during starvation；Fig.10 POX during active period；Fig.11 POX during hibernation；Fig.12 POX during starvation；Fig.13 SDH during active period；Fig.14 SDH during hibernation；Fig.15 SDH during starvation；Scale bar：50 μm

SDH活性部位呈藍紫色（圖13－圖15），主要位于肝細胞的胞質內且呈顆粒狀分布，不同生理時期顆粒密集程度不同，活動期 SDH活性顯著較高（P＜0.05），顆粒分布較為密集，顏色較深，饑餓期和冬眠期SDH活性顯著降低（P＜0.05），染色較淺，二者間酶活性無顯著差異（P＞0.05）。

討 論

肝糖原是人和動物體內的貯備多糖，肝糖原在酶促作用下合成和分解以維持血糖濃度穩(wěn)定。本研究顯示，饑餓狀態(tài)下牛蛙肝糖原含量顯著降低，表明牛蛙饑餓時會分解肝糖原用于維持自身的生命活動，與魚類、哺乳動物等饑餓時肝糖原含量變化對于饑餓的適應性相一致［6，7］；冬眠期牛蛙肝糖原含量與活動期無顯著差異，表明冬眠前牛蛙會儲備較多肝糖原，這支持肝糖原是兩棲動物冬眠期的主要儲能和抗凍保護物質的觀點［2-5］，提示在牛蛙的養(yǎng)殖實踐中可根據肝糖原的含量來判斷牛蛙的營養(yǎng)狀況從而合理飼喂以保證其安全越冬。

NSE是一種水解酶，主要參與酯類物質的水解［10］。本研究顯示，活動期牛蛙肝臟NSE活性最高，饑餓期NSE活性顯著降低，這可能是對饑餓期肝細胞內酯類營養(yǎng)物質減少的適應。冬眠期NSE活性最低，表明冬眠期牛蛙肝細胞對酯類利用較少，可能與肝細胞中儲存有大量肝糖原，機體主要通過分解肝糖原獲取能源物質有關，這也進一步表明蛙類冬眠期主要通過消耗肝糖原來維持機體代謝活動。

ALP為磷酸酶的一種，結合于細胞膜上，主要參與脂類、葡萄糖、鈣和無機磷酸鹽等營養(yǎng)物質的吸收［11］。本研究顯示，活動期牛蛙肝臟 ALP活性顯著高于其他時期，饑餓期牛蛙肝臟ALP活性最低，這一結果與泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）在饑餓狀態(tài)下肝臟ALP活性的變化相一致［6］，表明饑餓狀態(tài)下牛蛙肝細胞的物質代謝活動明顯變弱。冬眠期 ALP活性仍較高，與活動期無顯著差異，表明冬眠期牛蛙肝細胞仍具有較強的吸收營養(yǎng)物質的能力。

POX存在于細胞的過氧化物酶體中，可以降低或消除細胞代謝過程中產生的過氧化氫、酚類和胺類等毒性物質，對機體起著保護作用［12］。本研究顯示，活動期牛蛙肝臟POX活性顯著較高，活動期牛蛙肝細胞代謝較為旺盛，會產生較多代謝毒物，較高的 POX活性可清除機體代謝產生的有毒物質，更好地起到保護作用。饑餓期POX活性最低，這與饑餓狀態(tài)下牛蛙肝臟代謝活動較弱，產生的代謝有毒物質較少相適應。冬眠期牛蛙肝臟POX活性保持較高水平，與活動期無顯著差異。有研究表明，蛙類冬眠期處于缺氧狀態(tài)，會產生較多自由基物質［13，14］，可見，冬眠期肝臟 POX活性保持較高水平有利于保護機體免受由缺氧引起的自由基損傷。

SDH是線粒體三羧酸循環(huán)的關鍵酶，SDH的活性常作為判定三羧酸循環(huán)運行強弱的指標［15］，本研究顯示，饑餓期與冬眠期牛蛙肝臟SDH活性均顯著降低，這與小白鼠肝臟 SDH活性變化對饑餓與寒冷的適應性基本一致［7］。活動期SDH活性較高，表明正常生理條件下肝細胞需要通過三羧酸循環(huán)產生足夠多的 ATP以維持機體正常的代謝活動，而饑餓期體內營養(yǎng)物質減少，SDH的活性降低可減少能量消耗；冬眠期動物的基礎代謝率降低，SDH活性降低可使三羧酸循環(huán)運行減慢以適應冬眠期較低的能量消耗。張建萍等［16］對虎斑頸槽蛇（Rhabdophis tigrinus lateralis）肝臟 SDH活性受溫度影響的研究顯示，5～15℃范圍內 SDH表現出較低活性，可見，冬季氣溫過低也是造成冬眠期肝臟SDH活性降低的原因。

總之，饑餓和冬眠期牛蛙肝糖原含量及各種酶活性的變化與肝臟生理功能及個體生命活動狀態(tài)是相適應的。冬眠期肝糖原含量及4種酶活性的變化與饑餓期有相似之處，亦存在明顯差異，反映出冬眠與饑餓后的生理變化既有相似性又存在差異。

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Changes in glycogen content and activities of some key enzymes in the liver of Rana catesbiana during starvation and hibernation

Zhang Jitai，Zhu Xue，Wang Huan，Wu Yuanyuan，Peng Fei，Zhang Shengzhou*
（Key Laboratory of Biotic Environment and Ecological Safety in Anhui Province，College of Life Sciences，Anhui Normal University，Wuhu 241000，China）

Objective To investigate changes in the glycogen content and the activities of non-specific esterase（NSE），alkaline phosphatase（ALP），peroxidase（POX）and succinate dehydrogenase（SDH）in the liver of Rana catesbiana during starvation and hibernation.Methods Frozen sectioning，PAS staining，enzyme-histochemical technique and optical density analysis were used.Results The glycogen content wass significantly decreased during starvation，while there was no significant difference between hibernation and the active period.The activity of NSE was highest during the active period，lower during starvation，and lowest during hibernation.The activities of ALP and POX were significantly decreased during starvation，while there was no significant difference between hibernation and the active period.The activity of SDH was significantly decreased during starvation and hibernation，but higher during the active period.Conclusion The change of hepatic glycogen content is inconsistent during starvation and hibernation，while the changes of other enzymatic activities are consistent.The changes of glycogen content and enzymatic activities in the liver of Rana catesbiana during starvation and hibernation are rational adaptive responses to the changes of the physiological status.

Rana catesbiana；Liver；Starvation；Hibernation；Histochemistry

Q959

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2015.05.016

2015-06-29

2015-09-16

安徽省自然科學基金（11040606M75）；國家級大學生校外實踐教育基地大學生創(chuàng)新訓練計劃項目；本科生優(yōu)秀畢業(yè)論文培育計劃項目（pyjh2013206）；生物環(huán)境與生態(tài)安全省級重點實驗室建設基金

張繼太，男（1991年），漢族，本科生

*通訊作者（To whom correspondence should be addressed）：

szzhang＠m(xù)ail.ahnu.edu.cn