劉 麗 君 何 菲 郭 珮 王 琦 王 弘 凱 冉 建 華*

（重慶醫(yī)科大學(xué)：1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室；2神經(jīng)科學(xué)研究中心，重慶 400016）

睡眠剝奪上調(diào)小鼠胰腺 TNF-α的表達(dá)

劉 麗 君1，2何 菲1，2郭 珮1，2王 琦1，2王 弘 凱1，2冉 建 華1，2*

（重慶醫(yī)科大學(xué)：1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室；2神經(jīng)科學(xué)研究中心，重慶 400016）

目的 探討睡眠剝奪對(duì)小鼠胰腺形態(tài)、功能的影響以及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）表達(dá)變化的病理意義。方法 C57雄性小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，睡眠剝奪24 h、48 h和60 h組，觀(guān)察各組小鼠的精神活動(dòng)狀態(tài)及體重變化；檢測(cè)血清淀粉酶（serum amylase，AMS）水平；采用 HE染色和免疫組織化學(xué)法觀(guān)察各組小鼠胰腺的組織學(xué)特征及TNF-α表達(dá)情況；Western Blot檢測(cè) TNF-α的表達(dá)水平。結(jié)果 隨睡眠剝奪時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組小鼠體重較正常對(duì)照組明顯下降。AMS水平在睡眠剝奪24 h顯著升高，48 h達(dá)到峰值后維持至60 h。HE染色可見(jiàn)睡眠剝奪組小鼠出現(xiàn)胰島細(xì)胞排列紊亂、胞質(zhì)濃縮、細(xì)胞間隙擴(kuò)大；外分泌部細(xì)胞酶原顆粒消失，細(xì)胞空泡化等病理改變；免疫組化及免疫印跡顯示，睡眠剝奪組小鼠胰腺中 TNF-α的表達(dá)隨剝奪時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯上調(diào)。結(jié)論 睡眠剝奪后不僅導(dǎo)致小鼠全身衰竭，并通過(guò)活化 TNF-α而誘導(dǎo)胰腺的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致其形態(tài)和功能損傷。

睡眠剝奪；胰腺；腫瘤壞死因子-α

在生活節(jié)奏日益加快、工作壓力不斷激增的今天，人們面臨越來(lái)越多的應(yīng)激事件，這種因工作或疾病等因素使得人們睡眠時(shí)間呈逐漸減少趨勢(shì)的狀態(tài)被稱(chēng)為睡眠剝奪（sleep deprivation，SD）。睡眠剝奪作為一種類(lèi)似于缺氧的應(yīng)激源，廣泛影響機(jī)體各系統(tǒng)的生理功能，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，成為日益突出的醫(yī)療及公共衛(wèi)生問(wèn)題［1］。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明［2-5］，睡眠剝奪可引起機(jī)體能量消耗增加，體重下降，免疫功能降低及條件性致病菌感染機(jī)會(huì)增加。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于睡眠剝奪病理機(jī)制的研究主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)，證實(shí)睡眠剝奪后引起的自由基產(chǎn)生增多，細(xì)胞抗氧化能力降低以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激三條途徑所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是睡眠剝奪誘發(fā)機(jī)體損傷的中心環(huán)節(jié)［6，7］。睡眠剝奪引起機(jī)體能量消耗的增加與氧化應(yīng)激密不可分，氧化應(yīng)激引起TNF-α增加導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)是急性胰腺炎的重要病理機(jī)制［8］；然而，睡眠剝奪后氧化應(yīng)激對(duì)胰腺形態(tài)和功能的影響如何卻未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究利用改良多平臺(tái)睡眠剝奪裝置建立小鼠睡眠剝奪模型，擬探討睡眠剝奪對(duì)胰腺組織結(jié)構(gòu)、功能損傷的影響以及 TNF-α的表達(dá)意義，為改變不良生活方式，預(yù)防及降低睡眠剝奪引起的胰腺損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1.材料

清潔級(jí)健康成年雄性 C57小鼠（體重16～21 g）48只由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，12 h光照（8：00-20：00），12 h黑暗，自由攝取水和食物，動(dòng)物房溫度保持在 22～24℃，濕度保持在60%～70%，避免噪音。

2.方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

將小鼠隨機(jī)分為4組，每組12只：正常對(duì)照組（Control，為排除隔離及水環(huán)境造成的影響而設(shè)置），睡眠剝奪24 h（SD 24 h）組，睡眠剝奪 48 h（SD 48 h）組，睡眠剝奪60 h（SD 60 h）組。

2.2 睡眠剝奪模型的建立

采用改良多平臺(tái)水環(huán)境睡眠剝奪法［9］（Modifid Multiple Platrorm Water Environmental Method，MMPWM）建立睡眠剝奪模型。實(shí)驗(yàn)箱為 40 cm×30 cm ×20 cm透明水箱，其內(nèi)分別設(shè)置20個(gè)直徑2.0 cm、高5.0 cm的圓形平臺(tái)，各平臺(tái)之間間距為6 cm。箱體內(nèi)注入自來(lái)水使其低于平臺(tái)約 1.0 cm，水溫保持在22℃左右，箱頂扣上柵欄式鼠籠蓋，放置飼料和水瓶。小鼠在平臺(tái)上可自由進(jìn)食飲水，并可在平臺(tái)間自由活動(dòng)；若其睡眠，會(huì)因肌張力松弛而垂頭觸水或落入水中驚醒。正常對(duì)照組采用與睡眠剝奪組規(guī)格一致的透明水箱，但其內(nèi)放置的平臺(tái)大小直徑為12.00 cm，小鼠在平臺(tái)上可自由活動(dòng)及睡眠。睡眠剝奪期間持續(xù)40 W日光燈照射，每日更換水及飼料。

2.3 血清學(xué)指標(biāo) AMS含量測(cè)定

各組小鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)以3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，摘除眼球后經(jīng)眼眶后靜脈叢取血，將靜脈血滴入4 ml消毒 EP管中靜置10 min，以4000 r／min離心10 min，上清液采用HITACHI-7150型自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清淀粉酶（serum amylase， AMS）含量。

2.4 HE染色

各組小鼠眼球取血后，固定于小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，剪除毛發(fā)及消毒后迅速剪開(kāi)腹部皮膚和胸骨以暴露心臟，以40 ml生理鹽水經(jīng)左心室沖洗后再以40 ml預(yù)冷的4%多聚甲醛灌流固定。取出胰腺置于4%多聚甲醛4℃過(guò)夜后用 30%蔗糖脫水，組織沉底后取出行常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚6μm。切片經(jīng)二甲苯和梯度酒精脫蠟水化后，蘇木素染色 5 min，自來(lái)水洗 l min。鹽酸乙醇分化30 sec，自來(lái)水浸泡15 min，置伊紅液 2 min，經(jīng)梯度乙醇脫水并依次脫色，最后用中性樹(shù)脂封片。光鏡觀(guān)察小鼠胰腺組織的形態(tài)學(xué)變化。

2.5 免疫組織化學(xué)和蛋白免疫印跡

胰腺切片經(jīng)二甲苯和梯度酒精脫蠟水化后，0.1 mol／L枸櫞酸鹽緩沖液修復(fù)抗原，PBS沖洗，3% H2O2溶液去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，滴加山羊血清工作液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)（北京中杉金橋生物有限公司），37℃ 30 min；滴加 TNF-α工作液（1：400，博士德生物有限公司），濕盒內(nèi) 4℃過(guò)夜；0.01M PBS沖洗后滴加生物素化二抗工作液，室溫孵育30 min，0.01M PBS沖洗，DAB鏡下顯色，蘇木素復(fù)染胞核，脫水、透明后中性樹(shù)膠封片。

總蛋白提取試劑盒（碧云天公司）提取胰腺各組總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，10%凝膠SDSPAGE分離蛋白，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗稀釋液稀釋的兔抗 TNF-α多克隆抗體（1：300）4℃孵育過(guò)夜，再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1：8000）雜交1 h，ECL顯色液顯色，膠片曝光，Image Tool分析軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度值分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（（±s））表示，多樣本均數(shù)比較時(shí)，組間采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析比較，以 P＜0.05表示差異有顯著性。

結(jié) 果

1.睡眠剝奪后小鼠一般狀態(tài)

正常對(duì)照組小鼠攝食無(wú)明顯變化，活動(dòng)自如，對(duì)聲光反應(yīng)較靈敏。睡眠剝奪初期，小鼠興奮性提高，對(duì)周?chē)碳し磻?yīng)敏捷；睡眠剝奪 24 h，小鼠表現(xiàn)出“激惹”現(xiàn)象，對(duì)撫摸刺激表現(xiàn)出尖叫、逃避，相互之間出現(xiàn)撕咬、打斗等明顯的攻擊行為；睡眠剝奪 48 h，小鼠較為虛弱，活動(dòng)明顯減少；睡眠剝奪 60 h，小鼠精神萎靡，全身顫抖，呼吸頻率加快，站立不穩(wěn)，對(duì)外界刺激反應(yīng)淡漠，呈極度虛弱狀態(tài)。

2.睡眠剝奪后小鼠體重的變化

實(shí)驗(yàn)前各組小鼠的體重?zé)o差異（P＞0.05）。正常對(duì)照組小鼠體重隨時(shí)間延長(zhǎng)略有增加。與正常對(duì)照組相較，小鼠的體重在 SD 24 h減少（P＜0.05），至 SD 48 h和SD 60 h體重呈逐漸減少趨勢(shì)（P＜0.05）（圖1）。

圖1 正常對(duì)照組與睡眠剝奪組的體重變化。*示與對(duì)照組相比，P＜0.05，n＝48Fig.1 Changes of weight between control group and sleep deprivation groups.*P＜0.05 compared with the control group，n＝48

3.血清淀粉酶 AMS的變化

正常對(duì)照組AMS水平約為806±46.9 U／L，小鼠AMS在睡眠剝奪后顯著升高，其中SD 24 h后高達(dá)2299±153.6 U／L，SD 48 h后達(dá)到2809±117.7 U／L的峰值（P＜0.01），SD 60 h后略有下降（P＜0.01），仍在2714±136.2 U／L的高水平（P＜0.01）（圖2）。

圖2 正常對(duì)照組與睡眠剝奪組AMS的變化。**示與對(duì)照組相比，P＜0.01，n＝48Fig.2 Changes of AMS level between control group and sleep deprivation groups.**P＜0.01 compared with the control group，n＝48

4.胰腺組織形態(tài)學(xué)改變

正常對(duì)照組小鼠胰島細(xì)胞排列規(guī)則，胞質(zhì)豐富；外分泌部腺泡細(xì)胞頂部富含酶原顆粒，胞核呈圓形位于基底部（圖3A）。睡眠剝奪24 h組小鼠胰島細(xì)胞排列不規(guī)則，部分細(xì)胞胞質(zhì)減少；外分泌部細(xì)胞的酶原顆粒有所減少，出現(xiàn)部分空泡（圖3B）。睡眠剝奪48 h組小鼠胰島細(xì)胞排列紊亂，胞核固縮，胞漿減少，細(xì)胞間隙增大；外分泌部細(xì)胞胞漿內(nèi)酶原顆粒釋放，部分細(xì)胞呈空泡狀（圖3C）。睡眠剝奪60 h組小鼠胰島部分細(xì)胞胞核消失，胞質(zhì)濃縮，間隙明顯擴(kuò)大；外分泌部細(xì)胞排列紊亂，大部分細(xì)胞胞漿酶原顆粒消失呈空泡狀 （圖3D）。

圖3 正常對(duì)照組與睡眠剝奪組胰腺的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化（HE 200×）。A，對(duì)照組；B，SD 24h組；C，SD 48h組；D，SD 60小時(shí)組。n＝12，紅箭示胰島細(xì)胞；黑箭示外分泌細(xì)胞Fig.3 Changes of morphological structure on pancreasbetween control group and sleep deprivation groups（HE 200×）.A.control group；B.SD 24 h；C.SD 48 h；D.SD 60 h.n＝12 Red arrows indicate the islet cells；Black arrows indicate the exocrine cells

5.胰腺免疫組織化學(xué)結(jié)果

TNF-α陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色，主要分布在胞漿。正常對(duì)照組小鼠胰腺組織中未見(jiàn) TNF-α表達(dá)（圖 4A）；SD 24 h組 TNF-α的表達(dá)主要集中在胰島，其外分泌部細(xì)胞胞漿內(nèi)TNF-α染色較淺淡（圖4B）。隨著睡眠剝奪時(shí)間的延長(zhǎng)，TNF-α在胰腺組織中胰島和外分泌部細(xì)胞的棕黃色染色明顯加深（圖4C和4D）。

6.Western Blot法檢測(cè)胰腺組織 TNF-α表達(dá)情況

正常對(duì)照組未見(jiàn) TNF-α陽(yáng)性條帶。睡眠剝奪24 h、48 h、60 h后均可見(jiàn)大小約為35KDa的TNF-α陽(yáng)性條帶（圖5A）。TNF-α的表達(dá)水平在SD 24 h明顯升高（P＜0.01），在SD 48 h達(dá)到峰值（P＜0.01），至 SD 60 h稍有降低，但表達(dá)仍在較高水平（P＜0.01）（圖5B）。

圖4 正常對(duì)照組與睡眠剝奪組胰腺組織 TNF-α表達(dá)情況（200×）。A，對(duì)照組；B，SD 24h組；C，SD 48h組；D，SD 60小時(shí)組。n＝12，藍(lán)箭示胰島細(xì)胞；黑箭示外分泌細(xì)胞Fig.4 Expression of TNF-α in pancreas between control group and sleep deprivation groups（200×）.A.control group；B.SD 24 h；C.SD 48 h；D.SD 60 h.n＝12 Blue arrows indicate the islet cells；Black arrows indicate the exocrine cells

圖5 正常對(duì)照組與睡眠剝奪組胰腺組織 TNF-α表達(dá)變化。**示與對(duì)照組相比，P＜0.01，n＝24Fig.5 Changedexpression of TNF-α in pancreas between control group and sleep deprivation groups.**P＜0.01 compared with the control group n＝24

討 論

現(xiàn)代社會(huì)因工作或疾病導(dǎo)致人們被動(dòng)的發(fā)生睡眠剝奪的現(xiàn)象越來(lái)越普遍，而睡眠剝奪對(duì)人體免疫力、內(nèi)分泌、心血管等系統(tǒng)均可造成嚴(yán)重影響［10］。機(jī)體在睡眠剝奪后處于高代謝狀態(tài)，能量消耗增加，出現(xiàn)進(jìn)食增多及體重下降等表現(xiàn)［2，10］。本研究發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪后小鼠精神萎靡，毛發(fā)蓬亂無(wú)光澤，活動(dòng)減少；同時(shí)體重明顯減輕，SD 24 h、SD 48 h、SD 60 h體重較正常對(duì)照組分別下降了14.3%，31.2%，48.3%，提示本研究的睡眠剝奪模型誘導(dǎo)了能量代謝異常。

研究表明，睡眠剝奪引起的能量代謝異?？僧a(chǎn)生大量的活性氧族，導(dǎo)致氧化應(yīng)激［11］。氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)小鼠胰腺組織中未折疊蛋白的過(guò)度表達(dá)，抑制胰島素的分泌從而升高血糖［12］，但卻缺乏形態(tài)學(xué)的證據(jù)以及外分泌部細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變。本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪 24 h、48 h、60 h后小鼠血清AMS含量較正常對(duì)照組顯著升高，這與 HE染色所見(jiàn)外分泌部腺泡細(xì)胞酶原顆粒消失、細(xì)胞空泡化的病理改變有關(guān)；同時(shí)，胰島細(xì)胞出現(xiàn)排列紊亂、胞質(zhì)濃縮、細(xì)胞間隙擴(kuò)大等形態(tài)學(xué)改變也解釋了胰島素分泌減少的原因。

胰腺結(jié)構(gòu)和功能的損傷與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。氧化應(yīng)激水平的增加促使 TNF-α的產(chǎn)生與胰腺病理?yè)p傷程度一致，從而成為衡量胰腺損傷的重要指標(biāo)［13，14］。這與睡眠剝奪后機(jī)體的抗氧化防御能力降低、前炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子的平衡失調(diào)有關(guān)，從而促使炎癥反應(yīng)的發(fā)生。本項(xiàng)研究中，正常對(duì)照組的胰腺組織未見(jiàn)TNF-α表達(dá)，而在SD 24 h后 TNF-α的表達(dá)量明顯升高，并隨睡眠剝奪時(shí)間延長(zhǎng)在48 h達(dá)到峰值，并維持高位水平至60 h，提示炎癥反應(yīng)的發(fā)生。免疫組化結(jié)果顯示，TNF-α陽(yáng)性染色分布在胰島細(xì)胞和外分泌部腺泡細(xì)胞胞漿中，并且胰島細(xì)胞的染色更深，提示睡眠剝奪可能影響胰島素的合成與分泌，進(jìn)而干擾機(jī)體的能量代謝，引發(fā)全身多系統(tǒng)的氧化應(yīng)激。

綜上所述，睡眠剝奪后能量代謝的異常誘導(dǎo)氧化應(yīng)激發(fā)生，進(jìn)而促使胰腺中炎癥因子 TNF-α大量表達(dá)，引起胰腺的炎癥反應(yīng)，造成胰腺細(xì)胞形態(tài)和功能損傷，其具體的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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Sleep deprivation up-regulates expression of tumor necrosis factor alpha in mouse pancreas

Liu Lijun1，2，He Fei1，2，Guo Pei1，2，Wang Qi1，2，Wang Hongkai1，2，Ran Jianhua1，2*
（1Department of Anatomy，College of Medicine；2Neuroscience Research Center，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

Objective To investigate the impact of sleep deprivation on morphology and function of pancreas in mice and the pathological significance of expression of tumor necrosis factor-α（TNF-α）.Methods C57 mice were randomly divided into four groups：control group，and groups with sleep deprivation for 24 h，48 h，60 h，respectively.The mice subjected to sleep deprivation were observed for the general state and changes of body weight；serum amylase（AMS）level was detected.Sectioned Pancreatic slices were observed by H＆E staining and immunohistochemical staining to test the histological changes and the expression of TNF-α.Western Blot assay was practiced to detect the expression of TNF-αin the pancreas.Results With the extension of time，the body weight of sleep deprived mice was significantly decreased compared with that of the control group.AMS levels in sleep deprived mice significantly increased at 24 h，reaching the peak at 48 h which lasted till 60 h.H＆E staining demonstrated that mice deprived of sleep showed turbid pancreatic islet cells，with cytoplast pyknosis，expansion of interstitial tissue，disappearance of zymogen granules and vacuolization of acinar cells.Immunohistochemistry and Western blot showed that the sleep deprivation groups had increasingly higher expression of TNF-αin the pancreas with the extension of deprivation.Conclusion Sleep deprivation causes systemic failure in mice，and activates TNF-α-induced inflammation of the pancreas，leading to its morphological and functional damage.

Sleep deprivation；Pancreas；TNF-α

R364.5

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2015.05.018

2015-06-05

2015-08-22

國(guó)家自然科學(xué)基金（30500171）；重慶市教委項(xiàng)目（KJ120330）；重 慶 市渝 中 區(qū)科 委 項(xiàng)目（20120202）。重慶醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生科學(xué)研究與創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（201403），國(guó)家（市）級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410631003）

劉麗君，女（1988年）漢族，研究生

*通訊作者（To whom correspondence should be addressed）：

1315038024＠qq.com