孫 洋 錢 方 趙 磊 劉曉慧 牟光慶

（1.大連工業(yè)大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034）

近年來隨著人們營養(yǎng)健康意識的增強(qiáng)，蛋白質(zhì)和脂肪含量相當(dāng)于原料乳10倍的干酪，成為世界上唯一保持連續(xù)上升的乳制品［1］。按生產(chǎn)1t干酪排放9t乳清計(jì)，每年有上億噸的乳清等待利用和處理［2］。乳清不僅產(chǎn)量大，且營養(yǎng)豐富（含乳清蛋白、脂肪、乳糖、礦物質(zhì)和水溶性維生素等），必需氨基酸組成完全符合或超出FAO/WHO要求［3］。由于蛋白酶能部分降解乳清蛋白多肽骨架，增加特殊功能基團(tuán)，具有改變?nèi)榍宓鞍椎娜榛浴⒎€(wěn)定性等功能特性［4］。也是降低其過敏反應(yīng)的有效方法之一［5］。本研究為便于乳清蛋白酶解后直接用于乳制品中，因此在自然pH下對乳清蛋白預(yù)處理及酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高乳清蛋白酶解產(chǎn)物的利用率和營養(yǎng)價值。

1 材料與方法

1.1 材料

乳清濃縮蛋白（WPC80）：美國哥蘭比亞乳業(yè)公司；

中性蛋白酶：酶活14.6萬U/g，廣西南寧龐博生物工程有限公司；

木瓜蛋白酶：酶活21.4萬U/g，廣西南寧龐博生物工程有限公司；

胰蛋白酶：酶活10.0萬U/g，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋：DK-S22型，上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

光柵分光光度計(jì)：722型，山東高密彩虹分析儀器有限公司；

精密pH計(jì)：pH S-3B型，上海雷磁儀器廠；

多管架自動平衡離心機(jī)：TDZ5-WS型，湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 測定項(xiàng)目及方法

（1）蛋白酶活力測定：福林—酚法［6，7］。

（2）蛋白含量測定：微量凱氏定氮法［8］。

（3）蛋白水解度（DH）測定：改進(jìn)pH-stat法［9，10］。

1.3.2 預(yù)處理方式對乳清蛋白酶解的影響 分別采用63℃/30min，80℃/10min，95℃/5min的預(yù)處理方式對乳清蛋白WPC80進(jìn)行處理，以未經(jīng)預(yù)處理的作對照。水解條件：WPC80 8%，初始pH 6.8，木瓜蛋白酶量5 000U/g·蛋白，溫度50℃，時間60min。通過乳清蛋白水解程度來確定最佳的預(yù)處理方式。

1.3.3 不同蛋白酶水解乳清蛋白的效果比較 選用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶，在加酶量5 000U/g·蛋白，初始pH 6.8，50℃，60min的條件下對終濃度8%的乳清蛋白（WPC80）進(jìn)行酶解，并經(jīng)沸水10min，冷至室溫后，通過比較水解程度來確定乳清蛋白酶解的最佳酶。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

（1）加酶量對酶解乳清蛋白的影響：在初始pH 6.8、水解溫度50℃、水解60min條件下，用最佳酶對終濃度8%的乳清蛋白進(jìn)行酶解，分別測定在1 000，3 000，5 000，7 000，9 000U/g·蛋白加酶量的水解度。

（2）水解溫度對酶解乳清蛋白的影響：在初始pH 6.8、加酶量5 000U/g·蛋白、水解60min條件下，用最佳酶對終濃度8%的乳清蛋白進(jìn)行酶解，分別測定在40，45，50，55，60℃水解溫度下的水解度。

（3）水解時間對酶解乳清蛋白的影響：在初始pH 6.8、水解溫度50℃、加酶量5 000U/g·蛋白條件下，用最佳酶對終濃度8%的乳清蛋白進(jìn)行酶解，分別測定30，60，90，120，150min水解時間的水解度。

1.3.5 正交旋轉(zhuǎn)回歸試驗(yàn)設(shè)計(jì) 基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以木瓜蛋白酶的水解溫度、水解時間和加酶量3個因素為自變量，以乳清蛋白水解度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)20個試驗(yàn)點(diǎn)的正交旋轉(zhuǎn)回歸試驗(yàn)，保證試驗(yàn)點(diǎn)最小的前提下，提高乳清蛋白酶解效率，并用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理方式對酶解乳清蛋白的影響

由于乳清蛋白的熱穩(wěn)定性較差，不同的預(yù)處理方式對其酶解效果影響較大。為了得到最佳水解效果，按表1的預(yù)處理方式及水解條件酶解乳清蛋白WPC，并測其水解度。

由圖1可知，其中80℃處理10min的水解度最大，達(dá)9.21%。所以選用80℃處理10min對酶解前乳清蛋白進(jìn)行預(yù)處理。

圖1 不同預(yù)處理方式水解乳清蛋白的比較Figure 1 Comparison of different pretreatments of enzymolysis of whey protein

2.2 不同蛋白酶水解乳清蛋白的效果比較

考慮到酶解反應(yīng)受溫度、加酶量、底物濃度和水解時間等多種因素影響。為尋找水解乳清蛋白的適宜酶及其最佳酶解條件，本研究分別用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶3種酶，在相同酶解條件水解乳清蛋白，比較其水解程度。由圖2可知，木瓜蛋白酶水解度最大，達(dá)8.96%。因此選用木瓜蛋白酶作為乳清蛋白水解最佳用酶。

圖2 不同蛋白酶水解乳清蛋白的比較Figure 2 Comparison of different proteases of enzymolysis of whey protein

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 加酶量對酶解乳清蛋白的影響 由圖3可知，在同一初始pH、水解溫度和時間下，當(dāng)木瓜蛋白酶量低于5 000U/g·蛋白時，乳清蛋白水解度隨酶量的增加而明顯升高；而加酶量高于5 000U/g·蛋白時，由于底物濃度和酶逐漸達(dá)到飽和，水解度升高幅度不明顯。因此，初步確定木瓜蛋白酶水解乳清蛋白適宜用酶量為5 000U/g·蛋白，相應(yīng)水解度DH為9.65%。

圖3 加酶量對蛋白酶水解乳清蛋白的影響Figure 3 Effects of different enzyme dosage on whey protein enzymolysis

2.3.2 水解溫度對酶解乳清蛋白的影響 由圖4可知，在同一初始pH、水解時間和加酶量下，酶解溫度控制在40～55℃時，乳清蛋白水解度隨溫度上升而增大，而高于55℃時，則隨著溫度升高，水解度降低，說明酶活力下降。木瓜蛋白酶水解乳清蛋白的適宜水解溫度為55℃，相應(yīng)水解度DH為9.96%。

2.3.3 水解時間對酶解乳清蛋白的影響 由圖5可知，在同一水解溫度、初始pH值和加酶量下，乳清蛋白水解度隨水解時間的延長而升高。而水解90min后，水解度趨勢線變緩。因此，初步確定木瓜蛋白酶水解乳清蛋白適宜水解時間為90min，相應(yīng)水解度DH為9.87%。

圖4 水解溫度對酶解乳清蛋白的影響Figure 4 Effects of different temperature on whey protein enzymolysis

圖5 水解時間對酶解乳清蛋白的影響Figure 5 Effects of different time on whey protein enzymolysis

2.4 正交旋轉(zhuǎn)回歸試驗(yàn)

2.4.1 正交旋轉(zhuǎn)回歸設(shè)計(jì)酶解乳清蛋白試驗(yàn)結(jié)果分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定的回歸正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)因素水平取值見表1，木瓜蛋白酶解乳清蛋白回歸正交旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3、4。

用Design-Expert軟件進(jìn)行回歸分析，對各因素回歸擬合后得回歸方程：

表1 正交旋轉(zhuǎn)回歸設(shè)計(jì)的因素水平編碼表Table 1 Factors level coding schedule of regression orthogonal rotary tests

表2 正交旋轉(zhuǎn)回歸設(shè)計(jì)酶解乳清蛋白試驗(yàn)與結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal rotational regression of whey protein enzymolysis

由表3可知，模型交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X2X3及二次項(xiàng)X22差異不顯著，模型一次項(xiàng)X2、X3及二次項(xiàng)X12、X32差異極顯著，模型一次項(xiàng)X1差異顯著，說明響應(yīng)面分析所選的3個主效應(yīng)顯著。其中各種因素間的交互作用較小。同時由F值（各項(xiàng)均方/剩余誤差均方）可看出，水解溫度、水解時間、加酶量3個因素中加酶量對乳清蛋白水解度影響最大，其次為水解時間和溫度。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3 Variance analysis table of the result of orthogonal tests

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3 Variance analysis table of the result of orthogonal tests

＊為顯著（P＜0.05），＊＊為高度顯著（P＜0.01）；F0.01（1，10）＝10.04，F(xiàn)0.05（1，10）＝4.96；F0.01（5，5）＝11.0，F(xiàn)0.05（5，5）＝5.05；F0.01（9，10）＝4.95，F(xiàn)0.05（9，10）＝3.02。

變異來源 系數(shù)估計(jì)值平方和SS 自由度 均方MS F 值 顯著性截距 10.40 ——X1 0.22 0.66 1 0.66 7.10 ＊X2 0.30 1.26 1 1.26 13.55 ＊＊X3 1.31 23.30 1 23.30 250.54 ＊＊X1X2 0.02 0.00 1 0.00 0.03 X1X3 0.01 0.00 1 0.00 0.01 X2X3 －0.04 0.01 1 0.01 0.13 ＊＊X12 －0.39 2.20 1 2.20 23.66 X22 －0.16 0.35 1 0.35 3.76 ＊＊X32 －0.40 2.28 1 2.28 24.52 ＊＊回歸模型30.35 19 29.42 9 3.27 35.16剩余誤差 0.93 10 0.09純誤差 0.18 5 0.04失擬項(xiàng) 0.75 5 0.15 4.17總變異

表4 乳清蛋白水解度模型的方差分析Table 4 Variance analysis of the model of DH

本試驗(yàn)?zāi)Ｐ筒煌幚黹g差異極顯著，說明回歸方程描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系時，其應(yīng)變量與全體自變量之間的線性關(guān)系是顯著的。同時變異系數(shù)（CV＝12.96%）也說明了這種試驗(yàn)方法是可靠的。復(fù)相關(guān)系數(shù)平方R2＝回歸平方和/總平方和＝96.94%，說明由這3個因素及二次項(xiàng)能解釋96.94%響應(yīng)值的變化。由表3可知，回歸方程的顯著性檢驗(yàn)F值＝35.16＞F0.01（9，10）＝4.95極顯著，說明試驗(yàn)數(shù)據(jù)與采用的數(shù)學(xué)模型相符合；回歸方程的失擬性檢驗(yàn)F值＝4.17＜F0.05（5，5）＝5.05不顯著，可認(rèn)為所選用的二次模型是適當(dāng)?shù)模?1－15］。

2.4.2 響應(yīng)面效應(yīng)分析 用Design Expert軟件進(jìn)行分析，作出響應(yīng)面和等高線，得到因素間的交互關(guān)系及對乳清蛋白水解度的影響。由圖6可知，水解體系加酶量一定時，乳清蛋白水解度隨著反應(yīng)時間增長而增大，當(dāng)時間達(dá)到一定值后水解度的增大變緩；在水解體系加酶量一定時，乳清蛋白水解度隨著溫度增加而增加，當(dāng)溫度達(dá)到一定時水解度開始下降。在適當(dāng)中間區(qū)域的反應(yīng)時間和溫度兩種因素交互作用下，可獲得水解度較高的酶解產(chǎn)物。

同樣，由圖7和8可看出，水解溫度與加酶量、水解時間和加酶量等之間的關(guān)系均與圖6水解溫度和水解時間的分析結(jié)果類似。

2.5 酶解乳清蛋白最佳水解條件確定

為進(jìn)一步確定乳清蛋白最佳酶解條件，對回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)為零整理得：

聯(lián)立上述3個方程求解，得到極值點(diǎn)X1＝0.324、X2＝0.794、X3＝1.607。換算后得乳清蛋白最優(yōu)酶解條件，即在反應(yīng)溫度56.62℃、加酶量為8 213.77U/g·蛋白條件下，木瓜蛋白酶水解乳清蛋白113.83min時能獲得最大水解度，其最大水解度為11.60%?？紤]到實(shí)驗(yàn)可操作性，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)在反應(yīng)溫度57℃、加酶量8 214U/g·蛋白、水解時間114 min條件下進(jìn)行，所得到乳清蛋白水解度為11.72%，與模型值（11.60%）相符。

圖6 水解溫度和水解時間對水解度的交互影響Figure 6 Mutual influence of temperature and time on DH

圖7 水解溫度和加酶量對水解度的交互影響Figure 7 Mutual influence of temperature and enzyme dosage on DH

圖8 水解時間和加酶量對水解度的交互影響Figure 8 Mutual influence of time and enzyme dosage on DH

3 結(jié)論

為更好地提高乳清蛋白酶解產(chǎn)物的利用率和營養(yǎng)價值，本研究比較了乳清蛋白在不同預(yù)處理方式下酶解程度，分析了酶切位點(diǎn)相異的蛋白酶自然pH下對乳清蛋白的酶解效果，并通過正交旋轉(zhuǎn)回歸設(shè)計(jì)優(yōu)化了乳清蛋白的酶解條件。研究表明乳清蛋白水溶液經(jīng)80℃10min預(yù)處理后，加入8 214U/g·蛋白的木瓜蛋白酶，57℃水解114min后能獲得最大水解度。以往關(guān)于酶解乳清蛋白的研究，都是控制蛋白酶在其各自最適pH下且未考慮預(yù)處理對水解產(chǎn)物的影響，這勢必會影響到乳清蛋白在食品中的應(yīng)用。本研究不僅提高了乳清蛋白酶解效率，同時還可將其酶解產(chǎn)物—乳清蛋白肽直接地應(yīng)用于液態(tài)乳制品等功能性食品中。

1 杜琨，張亞寧.干酪的營養(yǎng)價值及研究動態(tài)［J］.中國食物與營養(yǎng)，1995（10）：45～46.

2 嚴(yán)寶興.乳清資源的綜合利用［J］.草業(yè)與畜牧，2008（9）：52～55.

3 郭本恒.乳品化學(xué)［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，2001：246～247.

4 Scheme I，Muschiolik G.Effects of various whey protein hydrolysates on the emulsifying and surface properties of hydrolysed lecithin［J］.Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2001（21）：107～117.

5 Ena J M，Van Beresteijn E C H，Robben A J P M，et al.Whey protein antigenicity reduction by fungal proteinases and a pepsin/pancreatic combination［J］.Journal of Food Science，1995，60（1）：104～116.

6 Mamoru S，Masao I，Masanori S，et al.A new method for protease activity measurement［J］.Analytical Biochemistry，1979，97（1）：11～16.

7 周景祥，王桂芹.蛋白酶和淀粉酶活性檢測方法探究［J］.中國飼料，2011（11）：78～86.

8 王鏡巖.生物化學(xué)［M］.第三版.北京：高等教育出版社，2002：196～199.

9 袁斌，呂桂善，劉小玲.蛋白質(zhì)水解度的簡易測定［J］.廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2002，21（2）：113～115.

10 Jens Adler-Nissen.Control of the proteolytic reaction and of the level of bitterness in protein hydrolysis processes［J］.Chem.Tech.Biotechnol.，1984（34B）：215～222.

11 官波，鄭文誠.山藥多糖提取工藝的優(yōu)化［J］.食品與機(jī)械，2010，26（1）：98～101.

12 劉軍海，黃寶旭，蔣德超，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化艾葉多糖提取工藝研究［J］.食品科學(xué)，2009，30（2）：114～118.

13 王曙光，賈士儒，喬長晟，等.響應(yīng)面法優(yōu)化雞骨泥酶解條件的研究［J］.中國釀造，2009（2）：80～82.

14 林偉靜，吳廣楓，王強(qiáng)，等.燕麥全粉中β－葡聚糖提取工藝優(yōu)化［J］.食品與機(jī)械，2010，26（1）：121～124.

15 吳波，陳運(yùn)中.響應(yīng)面分析法優(yōu)化魚鱗脫鈣條件的研究［J］.食品科學(xué)，2008（9）：123～129.