陳忠輝

（新疆兵團第五師八十六團南區(qū)醫(yī)院，博樂833414）

血管瘤是由血管形成異常而引起的疾病。50%以上發(fā)生于頭頸部。口腔頜面血管瘤是頜面外科常見的一種良性血管腫瘤，雖然大多數(shù)血管瘤能自發(fā)消退，但是一些血管瘤病變可嚴重損壞正常組織，并產(chǎn)生并發(fā)癥［1］，往往給患者及其家人帶來極大痛苦。但關(guān)于血管瘤的發(fā)病機制，目前還未明了，這對于血管瘤的臨床治療也是目前急待解決的關(guān)鍵問題。

TIP30（Tat interacting protein 30）基因是新近發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制基因，可抑制腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移侵襲，促進腫瘤細胞的凋亡，抑制腫瘤血管的生成。它在多種腫瘤組織中的表達明顯減少，如黑色素瘤、胃癌、惡性膠質(zhì)細胞瘤、乳腺癌和肝細胞癌等，序列分析發(fā)現(xiàn)TIP30蛋白與腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因CC3基因為同一蛋白。近年來的研究表明，TIP30參與細胞調(diào)控，促進腫瘤細胞凋亡［2］、抑制腫瘤新生血管生成［3］以及抑制骨橋蛋白［4］等，從而抑制腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移。表明TIP30／CC3基因的表達失調(diào)與腫瘤之間存在密切關(guān)系。

研究應(yīng)用免疫組織化學方法和圖像分析技術(shù)檢測了口腔血管瘤及正常周圍組織中TIP30／CC3基因表達水平，探討TIP30／CC3基因在口腔血管瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的表達變化，為臨床上治療口腔血管瘤提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1材料

1.1 材料來源 收集新疆兵團第五師醫(yī)院病理科2008－2013年口腔血管瘤存檔蠟塊20例，其中男性15例，女性5例。這些血管瘤所在的部位主要為頜面部。患者術(shù)前均未做任何輔助性治療。

1.2 材料分組 將所有標本進行免疫組織化學S－P法檢測增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA），按 Mulliken分類標準并結(jié)合PCNA的表達進行分組：石蠟標本中增生期血管瘤12例，退化期血管瘤8例。另取距癌組織5cm外的周圍正常頜面部組織5例作對照。

1.3 主要試劑 即用型鼠抗人PCNA單克隆抗體、鼠抗人TIP30／CC3單克隆抗體（購于北京中杉生物技術(shù)有限公司）；超敏即用型SP通用型免疫組織化學試劑盒（購于福州邁新公司）；DAB顯色試劑盒及多聚賴氨酸（購于北京中杉生物技術(shù)有限公司）。

2方法

2.1 免疫組織化學SP法檢測TIP30／CC3和PCNA相關(guān)抗原

具體步驟：（1）4μm組織切片常規(guī)脫蠟入水；（2）抗原修復(fù)（檸檬酸緩沖液微波抗原修復(fù)法）；（3）滴加3%H2O2，37℃濕盒孵育10min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性；（4）正常羊血清37℃濕盒孵育10min以減少非特異性背景；（5）分別滴加一抗；（6）滴加鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物復(fù)合物37℃濕盒孵育；（7）滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色；（8）蘇木素復(fù)染；（9）梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢；（10）用PBS代替一抗作為陰性對照組，購買的陽性片作為TIP30／CC3的陽性對照組，人正常皮膚組織作為PCNA的陽性對照組。

2.2 免疫組織化學結(jié)果判斷

（1）TIP30／CC3以細胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，PCNA以細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。陰性對照組除細胞核染成藍色外，應(yīng)無棕黃色反應(yīng)物。

（2）采用HPIAS－1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)（同濟千屏影像公司）對TIP30／CC3的表達進行定量分析，每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測定每個視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細胞總面積，計算陽性面積率。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。（陽性面積率＝單位面積中陽性反應(yīng)的總面積／單位面積中細胞的總面積×100%）

3.統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，用SPSS11.5軟件對各組免疫組織化學反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和SNK（q）檢驗，檢驗水準α為0.05。

結(jié) 果

1 PCNA的表達

增生期血管瘤內(nèi)皮細胞核肥大，核內(nèi)彌漫分布棕黃色顆粒，PCNA表達強（圖1）；退化期血管瘤內(nèi)皮細胞核扁平，胞核內(nèi)有少量棕黃色顆粒，PCNA表達弱（圖2）。

2 TIP30／CC3的表達

增生期血管瘤內(nèi)皮細胞膜或胞漿內(nèi)有少量的棕黃色顆粒，TIP30／CC3呈低表達（圖3）；退化期血管瘤內(nèi)皮細胞胞膜或胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒，TIP30／CC3呈高表達（圖4）；正常皮膚組織內(nèi)皮細胞膜或胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒，TIP30／CC3呈高表達（圖5）。圖像分析結(jié)果見表。增生期組TIP30／CC3的表達明顯低于退化期組和正常組織（P＜0.05），而后兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

討 論

血管瘤以內(nèi)皮細胞異常增長為其特點，血管內(nèi)皮細胞在血管瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，而血管內(nèi)皮細胞生長受制一系列正調(diào)控因子和負調(diào)控因子的調(diào)節(jié)［5－7］。一般認為血管內(nèi)皮細胞的增殖與消退是血管瘤生長和消退的關(guān)鍵原因。近年來的許多研究表明，內(nèi)皮細胞增殖和凋亡是血管瘤增生、消退的病理組織學基礎(chǔ)，內(nèi)皮細胞凋亡是血管瘤自然消退的關(guān)鍵所在。

TIP30是一種30KD的Tat結(jié)合蛋白，又稱為HTATIP2 （HIV1Tat interactive protein 2），是Xiao H 等［8］通過研究人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV ）的體外轉(zhuǎn)錄時發(fā)現(xiàn)的。TIP30作為HIV轉(zhuǎn)錄的輔助因子可以和Tat結(jié)合蛋白相互結(jié)合從而提高HIV的增殖。通過序列分析發(fā)現(xiàn)TIP30和腫瘤抑制基因CC3為同一蛋白。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)TIP30/CC3在多種腫瘤組織中的表達率明顯降低，如乳腺癌、肝細胞癌、黑色素瘤、惡性膠質(zhì)細胞瘤、結(jié)腸癌等，證明TIP30／CC3的下調(diào)與腫瘤的發(fā)生存在密切關(guān)系［9－15］。其主要機制是通過抑制血管的生成和促進細胞的凋亡來實現(xiàn)的。

表1 口腔血管瘤不同時期TIP30／CC3表達的平均光密度和陽性面積率（）Table 1 The average optical density and the rate of TIP30／CC3positive area in different period of human dermal hemangiomas（）

表1 口腔血管瘤不同時期TIP30／CC3表達的平均光密度和陽性面積率（）Table 1 The average optical density and the rate of TIP30／CC3positive area in different period of human dermal hemangiomas（）

＊增生期組與退化期組比較，P＜0.05；（Comparison between proliferatinghemangiomas and involuting hemangiomas）＊P＜0.05；△退化期組與正常組比較，P＞0.05；（Comparison betweeninvoluting hemangiomas and normal skin tissue）△P＞0.05；▲正常組與增生期組比較，P＞0.05（Comparison between proliferatinghemangiomas and normal skin tissue） ▲P＞0.05

Groups例數(shù)N平均光密度Average Optical Density組別Rate of Positive Area 陽性面積率Involuting Group正常組 5 0.2980±0.0324▲ 0.2859±0.0318▲Normal Grou＊Proliferating Group退化期組 8 0.2868±0.0323△ 0.2788±0.0316△增生期組 12 0.0804±0.0104＊ 0.0721±0.0103 p

研究結(jié)果顯示：口腔血管瘤增生期組織中TIP30／CC3基因的表達明顯低于退化期血管瘤和正?？谇徽衬そM織（P＜0.05）。腫瘤的發(fā)生是一個復(fù)雜的過程，是多因素、多基因發(fā)生改變所造成的。我們實驗的結(jié)果顯示：抑癌基因TIP30/CC3可能通過促進血管瘤內(nèi)皮細胞的凋亡參與血管瘤的退化過程，表明TIP30表達失調(diào)可能與口腔血管瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。血管瘤是一種血管生成控制失去平衡而引起的疾病，為研究惡性腫瘤血管生成提供了一個良好的模型。血管生成是多種調(diào)節(jié)因子共同參與相互作用的結(jié)果，健康狀態(tài)下，機體通過這些因子的完美平衡來控制血管生成。研究這些因子在血管瘤形成過程中的表達可以為研究腫瘤的血管生成提供參考和指導(dǎo)，通過了解這些調(diào)節(jié)因子在腫瘤血管生成中的作用，為抑制腫瘤的血管生成提供理論和方法學依據(jù)。

因此，進一步研究TIP30基因與血管瘤其它生物學指標的關(guān)系及其相互作用機制，將有助于了解血管瘤發(fā)病的分子生物學機制，進而指導(dǎo)臨床治療。今后的實驗中我們將進一步探索TIP30基因在多種腫瘤組織表達降低的機制，涉及到哪些分子調(diào)控通路，并希望通過基因或蛋白水平的干預(yù)來阻斷其分子調(diào)控通路，為今后多種腫瘤的生物治療提供實驗依據(jù)。

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圖 版 說 明

圖1 增生期血管瘤PCNA的表達

增生的內(nèi)皮細胞核內(nèi)彌漫分布棕黃色顆粒（→），PCNA表達強，S－P×200

圖2 退化期血管瘤PCNA的表達內(nèi)皮細胞核內(nèi)有少量棕黃色顆粒（→），PCNA表達弱，S－P×200

圖3 增生期血管瘤TIP30／CC3的表達增生期血管瘤內(nèi)皮細胞膜或胞漿內(nèi)有少量的棕黃色顆粒，TIP30／CC3呈低表達（→），S－P×200

圖4 退化期血管瘤TIP30／CC3的表達退化期血管瘤內(nèi)皮細胞胞膜或胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒，TIP30／CC3呈高表達（→），S－P×200

圖5 正常對照組TIP30／CC3的表達正常皮膚組織內(nèi)皮細胞膜或胞漿內(nèi)有較多棕黃色顆粒，TIP30／CC3呈高表達（→），S－P×200

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1PCNA expression in proliferating hemangiomas SP ×200

Fig.2PCNA expression in involuting hemangiomas SP ×200

Fig.3TIP30／CC3expression in proliferating hemangiomas SP×200

Fig.4TIP30／CC3expression in involuting hemangiomas SP×200

Fig.5TIP30／CC3expression in normal skin tissue SP ×200