姚 生 朱嫻穎 許霞青 解 杰 王建超＊

（1華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院骨外科；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，武漢430030）

腫瘤臨床治療中癌細(xì)胞不易被徹底殺死，部分殘存的癌細(xì)胞會導(dǎo)致日后腫瘤復(fù)發(fā)。這是臨床腫瘤治療所面臨的重要問題之一。最近研究發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞的一種特殊自身保護(hù)機(jī)制——細(xì)胞自噬——可能是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)的因素之一［1－5］，研究擬用體外細(xì)胞培養(yǎng)，MTT（細(xì)胞存活率檢測）和免疫細(xì)胞化學(xué)方法證實(shí)不同濃度腫瘤化療藥物（順鉑）對癌細(xì)胞生存的影響，探討這種影響與腫瘤細(xì)胞增殖和自噬因子：損傷調(diào)控自噬因子（DRAM）和輕鏈3β（LC3β）表達(dá)變化之間是否存在相關(guān)性。

材料和方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)

B16－F10細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，使用含有6%胎牛血清的DMEM／high glucose培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每2－3d更換一次培養(yǎng)基。細(xì)胞生長至70%－80%豐度時(shí)，傳代或用于試驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分組：B16－F10細(xì)胞共分成七組：1號組為正?？瞻讓φ战M，2號－7號組分別為每毫升8？倕g，16？倕g，32？倕g，64？倕g，128？倕g，256？倕g順鉑損傷組。

2.MTT細(xì)胞活力測定

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以每孔8000－10000個(gè)／ml細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，后加入100ml用6%胎牛血清的DMEM／high glucose培養(yǎng)基稀釋的順鉑，終濃度為8，16，32，64，128，256μg／ml。對照組加100ml 6%胎牛血清的DMEM／high glucose培養(yǎng)基。每組5個(gè)復(fù)孔。

順鉑作用6小時(shí)后，每孔加入20μl MTT溶液（5mg／ml，即0.5%MTT），37℃、5%CO2環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，孔底有藍(lán)紫色結(jié)晶物質(zhì)析出。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μl二甲基亞砜（DMSO），避光37℃恒溫?fù)u床上低速振蕩15 min，使結(jié)晶物充分溶解。DG－3022A酶標(biāo)儀OD 490nm處測量各孔的吸光值。根據(jù)下列公式計(jì)算抑制率：抑制率 %＝［（對照組 A－實(shí)驗(yàn)組 A）／對照組A］×100%，并根據(jù)以上結(jié)果用82798－IC50軟件計(jì)算出順鉑作用的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

3.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以5×104個(gè)／ml細(xì)胞濃度接種于24孔板中，每孔加入500μl用6%胎牛血清的DMEM／high glucose培養(yǎng)基稀釋的順鉑，終濃度為100、200／ml。對照組加500μl 6%胎牛血清的DMEM／high glucose培養(yǎng)基。每組均做3個(gè)復(fù)孔，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，6h后，用PBS（pH 7.4）漂洗3次，多聚甲醛固定及PBS洗后，3%Triton X－100處理30min，3%H2O230min。2%BSA封閉后加入一抗，DRAM（1∶100Santa Cruz）25℃溫育2小時(shí)。LC3β組使用LC3β（1∶60 Santa Cruz），25℃溫育2h。二抗用生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG工作液（1∶200），25℃溫育1h；清洗后滴加SABC工作液（1∶200），25℃溫育1h。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水、二甲苯透明、封片。

結(jié) 果

1.MTT（細(xì)胞存活率檢測）

圖1 順鉑對腫瘤細(xì)胞存活率檢測Fig.1MTT Test for the effect of cisplatin on tumor cell survival rate

MTT實(shí)驗(yàn)觀察到隨著順鉑濃度的增加和時(shí)間的延長，腫瘤細(xì)胞的存活率逐漸地下降。但在小劑量的順鉑治療早期，細(xì)胞的存活率有一個(gè)短暫的升高。

2.免疫組織化學(xué)

圖2 順鉑對腫瘤細(xì)胞NS，DRAM LC3β表達(dá)的影響 ×400Fig.2The effect of cisplatin on Expression of NS，DRAM LC3β×400

免疫細(xì)胞化學(xué)觀察到NS在腫瘤細(xì)胞核或核仁表達(dá)，在用相對較低濃度順鉑（200μg／ml）培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中，NS表達(dá)明顯增強(qiáng)。但在相對較高濃度順鉑（400μg／ml）培養(yǎng)中，腫瘤細(xì)胞NS表達(dá)率明顯下降（見圖2）。

研究免疫細(xì)胞化學(xué)同時(shí)也觀察到DRAM在腫瘤細(xì)胞的核膜周圍表達(dá)，在用相對較低濃度順鉑（200μg／ml）培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中，DRAM 表達(dá)明顯增強(qiáng)。但在相對較高濃度順鉑（400μg／ml）培養(yǎng)中，腫瘤細(xì)胞DRAM陽性表達(dá)率明顯減少（見圖2）。

研究免疫細(xì)胞化學(xué)同時(shí)也觀察到LC3β在腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)或突起中表達(dá)，多呈顆粒狀。在用相對較低濃度順鉑（200μg／ml）培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中，LC3β表達(dá)明顯增強(qiáng)。但在相對較高濃度順鉑（400 μg／ml）培養(yǎng)中，腫瘤細(xì)胞LC3β陽性表達(dá)率明顯減少（見圖2）。

討 論

腫瘤治療相關(guān)的研究常常注意的是腫瘤細(xì)胞壞死和凋亡，但是經(jīng)過抗腫瘤藥治療，引起的細(xì)胞凋亡和壞死，不能很好解釋腫瘤細(xì)胞在治療以后復(fù)發(fā)的問題。近年來對腫瘤治療的研究認(rèn)為細(xì)胞自噬是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)鍵［6－9］。

MTT實(shí)驗(yàn)觀察到在低劑量順鉑治療時(shí)，細(xì)胞的存活率有瞬間短暫上調(diào)現(xiàn)象。順鉑對于腫瘤細(xì)胞的生長有明顯的抑制或殺傷的藥理學(xué)作用，本實(shí)驗(yàn)觀察到在較大劑量順鉑的作用下腫瘤細(xì)胞的存活率明顯減少。值得注意的是在小劑量順鉑作用的早期腫瘤細(xì)胞在一個(gè)限定的低濃度的順鉑范圍內(nèi)，細(xì)胞的存活率卻有一定的提高（見圖1）?？梢哉J(rèn)為在順鉑對細(xì)胞存活率的這種影響可能提示與細(xì)胞自噬有關(guān)［10－11］。

研究觀察到免疫細(xì)胞化學(xué)在順鉑（200μg／ml）培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中，NS表達(dá)明顯增強(qiáng)。NS在細(xì)胞核或核仁表達(dá)，是一種與干細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)的細(xì)胞因子。在不同濃度組順鉑的影響下，NS表達(dá)明顯增高說明細(xì)胞的增殖能力或者是細(xì)胞的活力仍然存在并有一定的增強(qiáng)。提示腫瘤細(xì)胞雖然經(jīng)過順鉑的處理，仍具有增殖的潛力［12］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示免疫細(xì)胞化學(xué)在順鉑（200μg／ml）培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中，DRAM 表達(dá)明顯增強(qiáng)。DRAM又稱損傷調(diào)控的自噬因子，主要在細(xì)胞核膜或胞質(zhì)表達(dá)，是一種與細(xì)胞自噬或影響P－53介導(dǎo)的凋亡相關(guān)的細(xì)胞因子［14］。實(shí)驗(yàn)觀察到在順鉑的影響下，DRAM表達(dá)明顯增高說明細(xì)胞受到藥物的影響，增殖能力或者是細(xì)胞的活力仍然存在。提示在低濃度順鉑的影響下，細(xì)胞仍然存活。因此，可以認(rèn)為DRAM表達(dá)結(jié)果可作為細(xì)胞自噬的另一重要證據(jù)［13－14］。

研究觀察到免疫細(xì)胞化學(xué)在順鉑（200μg／ml）培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中，LC3β表達(dá)明顯增強(qiáng)。LC3β又稱輕鏈3分子，它有兩個(gè)亞型，α和β。LC3β常和RNA結(jié)合，是一種被公認(rèn)的自噬標(biāo)志物，免疫組化顯示主要在細(xì)胞自噬小體，因此在胞質(zhì)中常呈顆粒狀分布。實(shí)驗(yàn)觀察到在順鉑的影響下，LC3β表達(dá)明顯增加，說明細(xì)胞受到藥物的影響，提示在低濃度順鉑的影響下，細(xì)胞仍然存活并進(jìn)入自噬狀態(tài)［15］。因此，可以認(rèn)為LC3β表達(dá)結(jié)果進(jìn)一步確定在低濃度順鉑的作用下，細(xì)胞進(jìn)入自噬狀態(tài)的直接證據(jù)。

綜合分析，可以發(fā)現(xiàn)在低濃度順鉑的作用下，在短時(shí)間內(nèi)，腫瘤細(xì)胞可能存活率不變或輕微下降，NS，DRAM和LC3β表達(dá)增加，提示腫瘤可能進(jìn)入細(xì)胞自噬狀態(tài)，這對腫瘤細(xì)胞自身是一種保護(hù)。但隨著時(shí)間的延長，藥物濃度的加大，細(xì)胞的存活率明顯下降，NS，DRAM和LC3β表達(dá)下調(diào)，提示更多的細(xì)胞進(jìn)入死亡或凋亡程序。

目前臨床腫瘤治療面臨著如何對化療藥物劑量或放療劑量的進(jìn)行恰當(dāng)選擇。過量化療或放療能更多的殺傷腫瘤細(xì)胞，但同時(shí)對機(jī)體自身的細(xì)胞也存在傷害。過少則有可能不能完全殺傷腫瘤細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入自噬狀態(tài)，為日后腫瘤復(fù)發(fā)留下隱患。因此，在腫瘤藥物應(yīng)用的同時(shí)，增加一些抗細(xì)胞自噬的藥物相配合，則可能為提高腫瘤的療效提供更有意義的思路。

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