堯 青 鄭 東 陳紅光

（湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管病變重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，咸寧437100）

糖尿病腦病作為糖尿病獨(dú)立的一個(gè)并發(fā)癥已被 醫(yī)學(xué)界所公認(rèn)，并逐漸成為基礎(chǔ)和臨床等相關(guān)學(xué)科的研究熱點(diǎn)。大量的流行病學(xué)研究表明不受控制的糖尿病會(huì)導(dǎo)致輕度的認(rèn)知功能障礙，增加阿爾茨海默病的風(fēng)險(xiǎn)［1－3］。海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，通過(guò)腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)系統(tǒng)和皮質(zhì)下行纖維接受來(lái)自視、聽(tīng)、痛、觸等多種感覺(jué)信息，參與外界信息向中樞傳導(dǎo)的整合，是研究大腦學(xué)習(xí)記憶功能的理想模型。有研究發(fā)現(xiàn)，高血糖一個(gè)月時(shí)腦顳葉皮層、海馬等區(qū)域內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯微血管病變，但神經(jīng)元已出現(xiàn)退行性改變［4］，可見(jiàn)海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化與糖尿病所致的認(rèn)知功能障礙等腦部病變密切相關(guān)。許多研究表明，姜黃屬中具有降脂、抗氧化、抗炎、抗微生物等多方面藥理作用的一種黃色酚類化合物——姜黃素（Curcumin，Cur）對(duì)糖尿?。?］及其常見(jiàn)并發(fā)癥［6－10］有保護(hù)作用，然而它在糖尿病腦部病變中的治療作用研究還比較少，因此通過(guò)檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元中凋亡相關(guān)因子Bcl－2，Bax和caspase－3的表達(dá)情況，觀察姜黃素對(duì)STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠海馬是否有抗凋亡的保護(hù)作用，為糖尿病腦部病變的研究和治療提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

健康雄性SD大鼠100只，體重100－160g，購(gòu)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。STZ（Sigma公司，貨號(hào) S0130），兔抗 Bcl－2抗體（sigma公司，貨號(hào)SAB4500003），兔抗Bax抗體（Abcam公司，貨號(hào)ab16837），兔抗caspase－3抗體（Abcam 公司，貨號(hào)ab59388），免疫組化試劑盒（谷歌生物，貨號(hào)G1003－2，包括HRP標(biāo)記的二抗和DAB）。

2.模型制備及分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于SPF動(dòng)物房，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，給予20只大鼠正常飲食作為生理鹽水對(duì)照組（Con租），給予80只大鼠高糖高脂飼料（由普通飼料加20%豬油和10%白糖組成）飲食作為糖尿病模型組（DM組）和姜黃素處理的模型組（DM＋Cur組）。4周后，Con組繼續(xù)給予正常飲食，DM組和DM＋Cur組大鼠通過(guò)腹腔注射STZ 35mg／kg來(lái)復(fù)制2型糖尿病模型。STZ注射72h后尾靜脈采血測(cè)血糖，以隨機(jī)血糖濃度≥16.7mmol／L作為糖尿病模型建立的成功標(biāo)準(zhǔn)。DM造模成功后，DM組大鼠繼續(xù)喂以高糖高脂飲食，DM＋Cur組大鼠則給予高糖高脂飼料和姜黃素300mg／kg／天（姜黃素由1%的羧甲基纖維素鈉（Na－CMC）配制，放入大鼠的水瓶中讓其飲用）處理。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，監(jiān)測(cè)大鼠體重及攝食量。姜黃素處理16周后，處死大鼠，檢測(cè)后續(xù)相關(guān)指標(biāo)。

3.免疫印跡（Western Blot，WB）檢測(cè)

各組大鼠處死后，迅速于冰上取海馬以0.1g組織加1ml蛋白裂解液的比例提取組織蛋白。根據(jù)常規(guī)的WB流程檢測(cè)各組大鼠大腦海馬中Bcl－2和Bax的蛋白含量：先用60～80V的電壓進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS－PAGE）電泳，然后將目的蛋白于250mA恒流轉(zhuǎn)膜80min轉(zhuǎn)移至PVDF膜；TBST溶液洗膜5min×3次；5%脫脂牛奶室溫封閉2h；兔抗一抗（1：1000）于4℃孵育膜過(guò)夜；TBST溶液洗膜10min×3次；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1：5000）室溫孵育膜1h；TBST溶液洗膜10min×4次；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）顯影成像，條帶用Quatity One軟件進(jìn)行分析。

4.免疫組織化學(xué)（IHC）檢測(cè)

各組大鼠處死后，迅速取腦置于4%甲醛溶液中固定12－24h，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟浸潤(rùn)并包埋成塊，石蠟切片機(jī)上行連續(xù)冠狀切片，片厚5μm，貼于明膠載玻片上。切片的免疫組織化學(xué)檢測(cè)，按常規(guī)免疫組化SP法操作：切片脫蠟水化；0.1%Triton X100破膜；微波修復(fù)；0.3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶；5%BSA封閉后滴加一抗4℃過(guò)夜，兔抗caspase－3抗體1∶700；然后用 HRP標(biāo)記的羊抗二抗室溫孵育45－60min后行DAB顯色。染色過(guò)程中各步驟之間均用PBS充分漂洗。顯色完后用蘇木素復(fù)染，然后脫水、透明、中性樹(shù)膠封片，在Olympus BX 53顯微鏡下觀察、攝片。免疫染色對(duì)照試驗(yàn)用PBS代替一抗，其余步驟相同。

5.顯微圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫染色切片均于Olympus BX53顯微鏡下用DP73高清成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描拍攝，圖片用Image－Pro－Plus 6.0軟件計(jì)數(shù)陽(yáng)性顯色的累計(jì)光密度值（IOD值）。WB條帶均用Quatity One軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

結(jié) 果

1.姜黃素對(duì)糖尿病大鼠體重和血糖的影響

各組大鼠在處死前檢測(cè)體重和隨機(jī)血糖，結(jié)果如表1所示：大鼠在SPF動(dòng)物房的良好環(huán)境里飼養(yǎng)二十多周以后，Con組體重增加很多，達(dá)到700.2g，但是血糖一直正常。DM組在給STZ之前，體重增加迅速，給予STZ造模成功后，食量減少，同時(shí)出現(xiàn)多飲和多尿癥狀，大鼠漸漸消瘦，體重下降，并且隨機(jī)血糖增高，在處死前，平均血糖達(dá)到21.04mmol／L；給予DM大鼠姜黃素處理16周后，總體狀態(tài)比DM組好，體重減弱沒(méi)有DM組明顯，隨機(jī)血糖也比DM組大鼠低，到大鼠處死前，DM＋Cur組大鼠隨機(jī)血糖為16.95mmol／L，這些數(shù)據(jù)表明姜黃素能從總體 上改善大鼠的糖尿病癥狀。

表1 各組大鼠體重和隨機(jī)血糖的比較（mean±SD）Table 1 The comparation of body weight and random blood glucose in each group rats（mean±SD）

2凋亡相關(guān)蛋白Bcl－2／Bax的WB檢測(cè)結(jié)果

各組實(shí)驗(yàn)大鼠大腦海馬的WB檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，大鼠海馬組織Bcl－2和Bax蛋白的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。與對(duì)照Con組相比，DM組Bcl－2蛋白表達(dá)降低而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)顯著升高；與DM組相比，DM＋Cur組Bcl－2蛋白表達(dá)明顯升高而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)降低（圖1A）。根據(jù) WB條帶分析得出的Bcl－2／Bax比值的比較見(jiàn)圖1B。

圖1 A：各組大鼠大腦海馬Bcl－2和Bax的WB條帶圖；B：Bcl－2／Bax的WB統(tǒng)計(jì)分析圖。＊ 與Con組相比P＜0.05，＃ 與DM組相比P＜0.05。Fig.1A：The WB bands of Bcl－2and Bax in each rats hippocampus；B：The WB statistical analysis chart of Bcl－2and Bax.＊compared with Con group，P＜0.05，＃compared with DM group，P＜0.05.

3caspase－3的IHC檢測(cè)結(jié)果

各組實(shí)驗(yàn)大鼠大腦海馬caspase－3的IHC顯色結(jié)果如圖2所示，Con組大鼠海馬CA1，CA3和齒狀回（DG）均只有較低水平的caspase－3表達(dá)，而DM組大鼠海馬各區(qū)的caspase－3陽(yáng)性表達(dá)均較Con組明顯增強(qiáng)，給于DM組大鼠姜黃素處理16周以后，海馬caspase－3陽(yáng)性表達(dá)明顯減弱，可見(jiàn)姜黃素對(duì)DM大鼠的海馬有抗神經(jīng)元凋亡的作用。

討 論

姜黃素是從姜黃屬中藥姜黃、郁金、莪術(shù)等的根、塊莖等處提取的一種黃色酚類化合物，原用做調(diào)味劑和食物色素，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明它具有降脂、

抗氧化、抗炎、抗微生物等多方面的藥理作用。近年來(lái)，關(guān)于姜黃素對(duì)糖尿病［5］及其并發(fā)癥如糖尿病腎?。?，7］、糖尿病心臟病變［8，9］、糖尿病眼部病變［10］等的治療作用的一些基礎(chǔ)和臨床研究已引起國(guó)內(nèi)外的重視。姜黃素對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的積極藥理作用也有 很 多 研 究，如 AD［11－13］、PD［14］、癲 癇［15］、腦 缺血［16］等。然而它在糖尿病腦部病變中的治療作用研究還比較少，因此本文以姜黃素為目標(biāo)藥物，通過(guò)檢測(cè)糖尿病大鼠大腦海馬神經(jīng)元中的凋亡調(diào)控蛋白Bcl－2與Bax和凋亡關(guān)鍵蛋白caspase－3的表達(dá)情況，研究姜黃素對(duì)糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元的抗凋亡保護(hù)作用。

圖2 A：各組大鼠大腦海馬CA1區(qū)，CA3區(qū)和齒狀回caspase－3的IHC顯色圖（×200倍）；B：各組大鼠IHC顯色后的統(tǒng)計(jì)分析圖。＊與Con組相比P＜0.05；＃與DM組相比P＜0.05.Fig.2A：The immunoreactivity of caspase－3in hippocampal CA1，CA3，and dentate gyrus areas in each group（×200）；B：The IHC statistical analysis chart of caspase－3in each group rats.＊compared with Con group，P＜0.05，＃compared with DM group，P＜0.05.

在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，有很多蛋白和細(xì)胞因子參與調(diào)控，其中，Bcl－2蛋白家族是調(diào)節(jié)線粒體通透性的主要成分，可通過(guò)形成同源（Bcl－2／Bcl－2，Bax／Bax）和異源（Bcl－2／Bax）二聚體對(duì)線粒體細(xì)胞凋亡途徑進(jìn)行調(diào)控。Bcl－2同源二聚體抑制細(xì)胞凋亡，Bax同源二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡。另外一個(gè)對(duì)細(xì)胞凋亡起重要調(diào)控作用的是caspase家族，它們是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，一旦被信號(hào)途徑激活，能將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解，使細(xì)胞不可逆的走向死亡。幾乎所有的細(xì)胞凋亡都會(huì)有這些調(diào)控因子的參與，因此，可以通過(guò)對(duì)這些調(diào)控因子定性定量的檢測(cè)，來(lái)反映細(xì)胞凋亡的程度。

本研究通過(guò)檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)大鼠細(xì)胞凋亡途徑中的Bcl－2、Bax和caspase－3表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，糖尿病大鼠海馬組織中的Bcl－2蛋白含量減少，而B(niǎo)ax蛋白含量升高，Bcl－2／Bax比值較Con組明顯減少，可見(jiàn)DM組大鼠海馬中異源（Bcl－2／Bax）二聚體和Bax同源二聚體的比例升高，更多的促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，同時(shí)通過(guò)IHC法對(duì)海馬各區(qū)caspase－3檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DM組caspase－3陽(yáng)性表達(dá)明顯增強(qiáng)，進(jìn)一步驗(yàn)證了DM組凋亡發(fā)生的增多。而給予姜黃素處理DM組大鼠16周后，促凋亡的各指標(biāo)表達(dá)都有下降，而抗凋亡蛋白Bcl－2水平升高，由此可見(jiàn)，姜黃素對(duì)DM組大鼠大腦海馬神經(jīng)元有抗凋亡的保護(hù)作用，這種保護(hù)作用可能與姜黃素的抗炎抗氧化作用相關(guān)［17－19］。

糖尿病腦病患者的認(rèn)知功能障礙是多種因素參與的復(fù)雜病理過(guò)程，到目前為止，其作用機(jī)制也未完全闡明，治療更是缺乏安全有效的藥物，現(xiàn)在姜黃素對(duì)糖尿病的治療作用已引起廣泛重視，并被制成膠囊制劑試驗(yàn)其降糖效果，如果其降糖抗氧化等藥理作用可以防治糖尿病腦病，將對(duì)糖尿病腦病患者的防治帶來(lái)新的方向。我們的研究也證實(shí)姜黃素對(duì)STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病模型大鼠海馬有抗凋亡的保護(hù)作用，希望能更進(jìn)一步研究其具體機(jī)制，為糖尿病腦病的研究和治療帶來(lái)新的依據(jù)，為姜黃素的治療作用提供科學(xué)基礎(chǔ)。

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