田 峰 王春芳 李鵬飛 李 宵 閆肖卿 景志杰

（山西醫(yī)科大學實驗動物中心；實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室，太原030001）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種嚴重的高致死致殘性創(chuàng)傷疾病，可由多種原因產(chǎn)生作用力于椎體內(nèi)的脊髓，致使脊髓受損后出現(xiàn)水腫、微血管出血以及神經(jīng)元壞死等［1］。世界衛(wèi)生組織2013年報告顯示，每年發(fā)生脊髓損傷人次多達50萬［2］。近些年來，脊髓損傷的研究已經(jīng)成為醫(yī)療領(lǐng)域中的一個熱門課題。因此，建立一種穩(wěn)定、可靠、重復性強，并能夠最大程度的接近臨床損傷情況的SCI模型，為脊髓損傷研究提供標準化動物模型，成為了許多實驗室的亟待解決的問題。

實驗室制作SCI模型一般分為三大類，分別是擠壓或挫傷模型、完全橫斷和局部離斷模型、缺血和化學損傷模型。每一類SCI模型都有各自的適用范圍，為了更接近人類臨床脊髓損傷后的情況，多數(shù)實驗室會選用擠壓／挫傷模型［3］。自1911年 Allen［4］首次運用重物自由落體原理實施垂直打擊脊髓來制作SCI模型以來，由此而產(chǎn)生的重物打擊脊髓儀器也不斷的被改進。利用上述原理，本課題組將一臺腦立體定位儀改裝成了自制Allen脊髓擊打儀。前期的實驗顯示，通過這臺儀器，本課題組成功建立了小鼠的脊髓損傷模型，能夠通過該儀器將從胎鼠提取的神經(jīng)干細胞注射入脊髓損傷小鼠的被打擊局部，從而嘗試對小鼠進行了神經(jīng)干細胞移植治療，并取得了一定的療效［5］。

為了進一步使小鼠脊髓損傷模型更加標準化、規(guī)范化，并能與國際標準化脊髓損傷模型接軌，便于在以后的實驗中對神經(jīng)干細胞移植的效果進行量化的分析，本課題組引進了由 The State University New Jersey設(shè)計制作的 Impactor M－Ⅲ脊髓撞擊器。本文將通過比較上述的兩種脊髓打擊儀器制作的SCI模型，討論兩種儀器在使用上的優(yōu)缺點。

材料和方法

1.實驗動物

清潔級昆明小鼠（由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供），40只，體重20－25g，BBB運動功能評分［6］為21分，雌雄不限，許可證號為：【SCXK（晉）2009－0001】。室溫條件下飼養(yǎng)，12h開／關(guān)日光燈交替照明，自由攝食和進水，每兩天更換一次墊料。術(shù)前3h停止進食和進水，于山西醫(yī)科大學實驗動物中心屏障環(huán)境動物實驗設(shè)施進行手術(shù)操作【SYXK（晉）2009－0004】。

2.實驗儀器

2.1自制Allen脊髓擊打儀

自制Allen脊髓擊打儀是根據(jù)Allen發(fā)明的重物墜落法原理，在現(xiàn)有的腦立體定位儀（深圳沃瑞德，68001型）的基礎(chǔ)上改造的一個準確、穩(wěn)定的脊髓擊打儀器。

改良過程：首先將原腦立體定位儀底部用來固定動物的裝置拆除；再將原有的三維操縱臂的單頭連接器改為一端可以連接一個中空的重物打擊桿，另一端連接微量注射器的雙頭連接器；然后將三維操縱臂與雙頭連接器組合安裝在定位儀上。同時，為重物打擊桿制作了專用的重物砝碼（外直徑為1cm，重量分別為5g、10g、20g三個重量砝碼）和壓迫砝碼（一個類似錐形的倒置砝碼；上部與重量砝碼接觸，直徑為1cm；下部與動物脊髓接觸，直徑為0.15cm）（圖1）。

操作時，先將壓迫砝碼置于重物打擊桿中，與實驗小鼠的脊髓暴露面接觸并輕度抬起；再將重量砝碼與長線相連，通過重量砝碼自由落體的作用撞擊壓迫砝碼，使得壓迫砝碼對實驗小鼠的脊髓造成設(shè)定重量的擊打損傷。

2.2Impactor M－Ⅲ脊髓撞擊器

Impactor M－Ⅲ脊髓撞擊器（W.M.Keck Ceter for Collaborative Neuroscience Rutgers，The State University New Jersey.USA）是設(shè)計用來為大小鼠施加可重復的標準脊椎撞擊的儀器。Impactor M－Ⅲ為SCI模型制作了固定重量的撞擊錘（大鼠：10g，脊髓接觸面直徑2.5mm；小鼠：5g，脊髓接觸面直徑1.2mm），可調(diào)控高度為0－99.99mm，可連續(xù)手動調(diào)節(jié)，并為減小誤差設(shè)計了釋放撞錘的電動控制按鍵。同時，Impactor M－Ⅲ脊髓撞擊器能夠與電腦進行數(shù)據(jù)連接，通過電腦采集數(shù)據(jù)，可制作出撞錘從設(shè)定高度（3.00mm，6.25mm，9.00mm，12.50mm，25.00mm，50.00mm，75.00mm）落到裸露脊髓表面的運動曲線，并能夠精確測量出撞錘在運動過程中各個節(jié)點的相關(guān)數(shù)據(jù)（圖2）。

圖1 自制Allen脊髓擊打儀Fig.1 Homemade Allen’s spinal cord

圖2 Impactor M－Ⅲ脊髓撞擊器Fig.2Impactor M－Ⅲ spinal cord contusion system

3.小鼠脊髓擊打模型的建立

3.1 動物分組

將實驗選取的40只小鼠隨機分為兩組，每組20只。一組用自制Allen脊髓擊打儀進行脊髓打擊（A組，n＝20），另一組用Impactor M－Ⅲ脊髓撞擊器進行脊髓打擊（B組，n＝20）。再將A、B兩組小鼠各分為兩部分A1、A2和B1、B2，A1、B1用于術(shù)后BBB運動功能評分（n＝10），A2、B2用于組織形態(tài)學觀察（n＝10）。

3.2 模型建立步驟

采用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，將小鼠的四肢固定于手術(shù)用托盤。常規(guī)消毒后，用手觸及小鼠最后一對肋骨下緣定位，并用剪刀延小鼠正中被毛從定位處向頭部方向切開一個1.5cm左右的縱向切口。逐層分離皮下組織，顯露棘突，直至暴露出T9－T11椎體。用鼠齒鑷夾住T9椎體，再用小紋式鉗咬除T9－T11的上部椎板（定位：T10為中心，T9棘突方向為斜向尾部，T11棘突方向為斜向頭部），直至顯露出一個長約8mm的脊髓面。分別采用兩種脊髓擊打儀器對暴露的脊髓面進行擊打?qū)嶒?，建立SCI模型，實驗高度為12.5mm，砝碼重量為5g。以小鼠尾部痙攣狀搖擺，雙下肢及軀體回縮撲動、雙下肢癱瘓作為造模成功標志。

術(shù)后將小鼠單獨分籠飼養(yǎng)，每12h按摩小鼠膀胱，幫助其排尿，直至恢復自主排尿。在相應(yīng)時間節(jié)點對實驗小鼠進行BBB運動功能評分，記錄評分結(jié)果。并且在3d、7d、14d、21d提取損傷小鼠的脊髓進行HE染色，觀察組織學形態(tài)。

4.統(tǒng)計學處理

所得數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件和EXCEL軟件處理，實驗結(jié)果采用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05時表明認為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.BBB運動功能評分

術(shù)后三周內(nèi)，對分籠飼養(yǎng)的A1、B1兩組受試實驗小鼠在6個不同的時間點：1d、3d、5d、7d、14d、21d采用BBB運動功能評分法進行評分。

術(shù)前受試的20只小鼠在BBB運動功能評分上并無差異，均保持在21分；術(shù)后1d、3d、5d以及進入穩(wěn)定期的21d，兩組BBB運動功能評分相近（P＞0.05），表明兩組恢復程度差異性不大；而在7d、14d，B1組評分明顯高于A1組（P＜0.05），表明在這兩個時間節(jié)點B1組恢復程度高于A1組（表1，圖3）。

表1 不同時間點各組BBB評分比較（）Table 1 Comparision of BBB scores in eash group at different times（）

表1 不同時間點各組BBB評分比較（）Table 1 Comparision of BBB scores in eash group at different times（）

注：＊該組與相鄰組同一時間點比較，P＜0.05.Note：＊P＜0.05，compared with the adjacent group at the same time.

組別Groups術(shù)后評分Postoperative scores 1d 3d 5d 7d 14d 21d A1組 21.00±0.00 0.10±0.32 0.40±0.52 1.00±1.05 3.40±1.43＊ 7.40±1.58＊術(shù)前評分Preoperative scores 14.70±2.91 13.4±3.13 B1組 21.00±0.00 0.20±0.42 0.40±0.70 1.90±1.37 5.10±1.37＊ 9.30±1.34＊

圖3 .各時間點BBB運動功能評分折線圖Fig 3.The line chart of every time BBB scores

圖4 Impactor M－Ⅲ脊髓撞擊器與電腦連接得到的撞錘下落曲線及數(shù)據(jù)Fig.4Impactor M－Ⅲ spinal cord contusion system and the computer to connect the rammer fall curve and data

2.Impactor M－Ⅲ脊髓撞擊器電腦數(shù)據(jù)

以上10幅坐標圖（圖3）是B1組10只小鼠由Impactor M－Ⅲ脊髓撞擊器進行擊打?qū)嶒灂r，電腦同步收集的相關(guān)數(shù)據(jù)。

圖中以重錘所在高度為縱坐標，時間點為橫坐標建立坐標圖。每幅坐標圖中均有7條曲線，分別代表撞擊錘運動高度變化（Impactor Ht）、實驗小鼠脊髓所在高度（Vertebral Ht）、撞擊錘第一次接觸脊髓時間（Contact）、脊髓形變時最低高度（Lowest CS Height）、脊髓表面高度（Cord surface）、撞擊錘速度（Velocity）、ImpVel Tang Line，并標有撞擊錘下落最高高度（Heighest Height）。從坐標圖中可以直觀的看出，Impactor M－Ⅲ脊髓撞擊器能夠精確的同步記錄打擊撞擊錘的運動軌跡及重錘相關(guān)數(shù)據(jù)。通過精確的限定實驗高度和其他相關(guān)條件，可以使實驗相關(guān)數(shù)據(jù)量化，穩(wěn)定性大大增強。

3.傷口對比

以下三張圖片為擊打手術(shù)前小鼠脊髓外觀情況和使用兩種脊髓打擊器制作的脊髓損傷模型后小鼠的脊髓組織外觀情況（圖5）。從圖中可以看出，使用自制Allen脊髓擊打儀得到的模型傷口處脊髓被膜無破損、無外部出血，脊髓內(nèi)部充血較明顯；而使用Impactor M－Ⅲ脊髓撞擊器得到的模型脊髓被膜有細小傷口并伴有出血。

圖5 兩種儀器擊打后脊髓組織情況（擊打前：脊髓被膜形態(tài)完整，正中有血管走行；A：脊髓被膜無破損，脊髓內(nèi)可見充血；B：脊髓被膜處有出血現(xiàn)象）Fig.5The structure of the spinal cord injury（Before injury：The intact dura；A：The blood under the intact dura can be seen after the injury；B：Spinal cord have bleeding phenomenon）

4.組織學改變

制作脊髓損傷后，脊髓組織內(nèi)的結(jié)構(gòu)形態(tài)、細胞狀況均發(fā)生變化?？梢娂顾鑳?nèi)出現(xiàn)大量血紅細胞，并伴有膠質(zhì)細胞增生、大量空泡產(chǎn)生等現(xiàn)象（圖6）。

圖6 脊髓擊打后HE染色（圖中脊髓形態(tài)完整，灰白質(zhì)界限清晰、結(jié)構(gòu)致密，神經(jīng)纖維排列整齊，打擊處可見大量紅細胞，組織結(jié)構(gòu)紊亂）Fig.6The result of HE staining of spinal cord injury（The spinal cordStructural integrity，boundary clearly in gray and white substance，Compact structure，Neat nerve fibers.A large number of red blood cells have been seen in wound and the structure disorder）

兩種儀器制作的模型在HE染色后，從得到的圖片上可以看出染色結(jié)果差異不大。均可見3d時，可見明顯的出血、充血現(xiàn)象，神經(jīng)細胞核碎裂，炎性細胞可見，炎性滲出；7d時，有較多的膠質(zhì)細胞增生出現(xiàn)，血管和間質(zhì)纖維輕度增生，組織疏松；14d時，組織結(jié)構(gòu)表疏松，灰白質(zhì)界限模糊，膠原纖維增多伴淀粉樣變性，并有大量空泡變性；21d時，有核細胞數(shù)量增多，均勻分布，有膠原穿插，結(jié)構(gòu)稍顯緊密（圖7）。

討 論

隨著現(xiàn)代社會各種交通運輸工具數(shù)量增多、建筑業(yè)的飛速發(fā)展，復雜環(huán)境和狀況對人類造成了傷害的幾率日益增加，相關(guān)的脊髓損傷患者數(shù)量也呈每年上升的趨勢。如何更加深入地研究和探索脊髓損傷后各項病理生理狀況及治療，成為了近幾年醫(yī)療領(lǐng)域的熱門課題。因而，在實驗室中，如何建立一個穩(wěn)定、準確、標準化強、操作性強、重復性好并且最大程度接近臨床脊髓損傷情況的動物模型就顯得至關(guān)重要。

實驗表明，自制Allen脊髓打擊器和Impactor M－Ⅲ脊髓撞擊器都能夠成功建立的兩組動物實驗?zāi)Ｐ停⑶覂山M模型均能很好反應(yīng)脊髓損傷后小鼠的運動功能恢復過程。并且，通過BBB運動功能評分發(fā)現(xiàn)兩種儀器所造模型恢復期間存在一定的差異，但在組織形態(tài)切片上差異顯示不大，可能由于兩臺儀器構(gòu)造及操作的不同造成。

圖7 各時間點脊髓損傷處HE染色（A1、B1：3d，神經(jīng)細胞核碎裂，有明顯充血出血，炎性滲出，炎細胞可見；A2、B2：7d，脊髓膠質(zhì)細胞增生，血管和間質(zhì)纖維輕度增生，組織疏松；A3、B3：14d，灰白質(zhì)界限模糊，膠原纖維增多伴淀粉樣變性，有空泡產(chǎn)生；A4、B4：21d，有核細胞增多，膠原穿插其中，結(jié)構(gòu)稍顯緊密）Fig.7Therusult of HE staining in different times（A1、B1：3d，karyorrhexis of neurone，hyperaemia，inflammatory exudation；A2、B2：7d，gliocyte proliferation，tissue loose；A3、B3：14d，boundary blurring in gray and white substance，glial scar as well as cavity were formed；A4、B4：21d，numerous nucleated cells，Collagen interwoven）

1.高度、重量、控制差異

自制Allen脊髓打擊器具有一個重物打擊桿，實驗者手動控制用長線連接的砝碼，經(jīng)過打擊桿中空的桿徑下落撞擊壓迫砝碼。在這一過程中，砝碼離脊髓面的高度由實驗者量取線長來確定，不能做到十分的精確，并且砝碼與桿內(nèi)壁會產(chǎn)生摩擦，出現(xiàn)誤差；實驗者手動控制砝碼的下落，這個過程砝碼高度也會有一定的誤差；壓迫砝碼是壓在裸露脊髓表面并輕微抬起，重量不計，這樣會使砝碼重量略微增大，存在一定的誤差［7］。從實驗結(jié)果中也可以看出，A組的損傷程度較B組略重，在7d、14d恢復高峰期相對恢復較慢。

Impactor M－Ⅲ脊髓撞擊器的砝碼高度是由機械控制，可以在0－99.99mm范圍內(nèi)連續(xù)調(diào)節(jié)，垂直運動距離準確度0.001mm，分辨率0.01mm；從得到的坐標圖也可以看出，撞擊錘下落最高高度（Heighest Height）的誤差被控制在5%以內(nèi)。采用電動按鈕機械控制砝碼的下落，也可減少摩擦帶來的誤差。但是Impactor M－Ⅲ的配套撞擊錘重量為大鼠10g、小鼠5g、撞擊錘為固定機械裝置，不能更換其重量，限制了實驗中對重量改變的要求。

2.傷口定位差異

自制Allen脊髓打擊器在操作時，是先將壓迫砝碼精確定位于脊髓暴露面并輕輕接觸，然后輕微抬起壓迫砝碼。這樣可以使脊髓在被擊打時受力均勻，并且可以避免脊髓因撞錘下沖而移位，不易造成脊髓偏擊，但脊髓內(nèi)出血現(xiàn)象較重。

Impactor M－Ⅲ脊髓撞擊器操作時，是先將撞擊錘定位于脊髓暴露面，精確定位后在手動調(diào)節(jié)機械臂，使撞錘上升到需要高度，按下電控按鈕，撞錘自由下落。這樣的方法容易使脊髓在被打擊時因形變移位導致砸偏而受力不均。如果高度定位較高，撞錘下落后會對脊髓產(chǎn)生沖擊傷，易刺穿脊髓表膜，造成出血較多。

所以從實驗結(jié)果可以看出，自制Allen脊髓打擊器制作的模型打擊程度較Impactor M－Ⅲ脊髓撞擊器制作的模型損傷程度重，但不易出現(xiàn)砸偏現(xiàn)象。

3.其他差異

在建立脊髓擊打模型的基礎(chǔ)上，自制Allen脊髓打擊器和Impactor M－Ⅲ脊髓撞擊器都增加了一些其他功能的設(shè)備，用來進一步進行損傷的后續(xù)實驗。自制Allen脊髓打擊器可以在雙頭連接器上可以加持一個微量注射器，利用三維空間定位的原理，為損傷脊髓后的實驗動物注射干細胞使用。而Impactor M－Ⅲ脊髓撞擊器可以與電腦相連接，實現(xiàn)數(shù)據(jù)的實時收集和分析。不僅能夠根據(jù)撞擊錘的下降情況繪制撞擊錘運動高度變化（Impactor Ht），而且還可以根據(jù)坐標圖中其他數(shù)據(jù)量化模型制作標準，如：根據(jù)脊髓所在高度（Vertebral Ht）與脊髓形變時最低高度（Lowest CS Height）計算出脊髓形變對小鼠存活時間的影響；根據(jù)撞擊錘速度（Velocity）來判斷摩擦力的變化，并且誤差能控制在5%以內(nèi)。為穩(wěn)定分析實驗撞擊數(shù)據(jù)提供技術(shù)支持，并且使實驗相關(guān)的各種數(shù)據(jù)得到了量化，使實驗穩(wěn)定性大大增強。

許多實驗室選用自制Allen脊髓打擊器，多因為自制Allen脊髓打擊器造價較低，能夠大大降低實驗成本。但是，使用和改裝方式不一致，使得得到的實驗數(shù)據(jù)無法用統(tǒng)一的標準來衡量；而Impactor M－Ⅲ脊髓撞擊器有著廣泛的使用群體，截止目前，國外有超過100個實驗室在使用，并且有超過50%的關(guān)于脊髓損傷研究文獻采用此種打擊器，但在國內(nèi)應(yīng)用較少。因此，使用該儀器可以很好的實現(xiàn)制作脊髓損傷模型標準化，與國際標準化接軌。但是Impactor M－Ⅲ脊髓撞擊器存在著價格昂貴、購買相對困難等問題。隨著脊髓損傷研究的廣泛展開和不斷深入，使用國際標準化的模型制備儀器必將成為以后大勢所趨。

綜上所述，本實驗采用了兩種不同的脊髓打擊儀器，分別建立兩組小鼠脊髓擊打模型。通過比較脊髓打擊實驗時兩種儀器的操作情況和脊髓打擊后兩組小鼠在恢復上的不同，對兩種儀器在脊髓擊打?qū)嶒炛谐霈F(xiàn)的各種優(yōu)缺點進行了說明。通過比較可以看出，兩種儀器都可以穩(wěn)定、準確的建立動物脊髓損傷模型。實驗者可以根據(jù)不同實驗的具體情況和要求或所在實驗室的要求來選擇使用不同的擊打儀器，從而得到可重復的脊髓損傷模型。但Impactor M－Ⅲ脊髓撞擊器的使用，會為數(shù)據(jù)化脊髓損傷模型提供可參考的實驗數(shù)據(jù)，為提高動物實驗?zāi)Ｐ偷某晒β侍峁┍Ｕ稀?/p>

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