余振興

武漢市醫(yī)療救治中心 武漢 430000

結(jié)核病是人畜共患的慢性傳染病，由結(jié)核分歧桿菌感染引起，給人類健康帶來嚴(yán)重威脅。結(jié)核性腦膜炎（TM）是由結(jié)核分歧桿菌引起的腦膜非化膿性炎癥，是慢性腦膜炎的常見類型，且是所有肺外結(jié)核菌感染疾病中最嚴(yán)重的［1-2］。TM患者若未經(jīng)治療，將在發(fā)病后4～8周病情加重，直至死亡。近年來，由于抗結(jié)核治療的不規(guī)范，結(jié)核多重耐藥菌株的出現(xiàn)導(dǎo)致免疫缺陷患者增加等因素使TM的發(fā)病率呈上升趨勢。同時臨床表現(xiàn)呈現(xiàn)多樣化，診斷難度增加，導(dǎo)致誤診率較高［3］。發(fā)展快速高效診斷TM的技術(shù)可避免因不當(dāng)治療引起的藥物不良反應(yīng)，并最大程度改善患者預(yù)后，降低TM的致死率和后遺癥發(fā)生率，已成為當(dāng)前TM控制的當(dāng)務(wù)之急。本研究通過FQ-PCR檢測34例TM患兒的TB-DNA水平，與結(jié)核涂片的結(jié)果對照，發(fā)現(xiàn)FQ-PCR檢測對TM具有較高的診斷價值?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2012-06—2014-01在我院接受治療的34例TM患兒為觀察組。臨床表現(xiàn)主要為結(jié)核中毒癥狀、顱內(nèi)高壓，以意識障礙、腦膜刺激征、錐體束征、腦神經(jīng)麻痹及癱瘓為常見神經(jīng)系統(tǒng)陽性體征。男22例，女12例；年齡6個月～4歲，平均（2.4±0.8）歲。有卡介苗接種25例，無卡介苗接種6例，卡介苗接種不詳3例。臨床分期：早期11例，中期14例，晚期9例。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合慢性腦膜炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，包括頭痛、發(fā)熱和腦膜刺激征，CSF呈非膿性炎性改變；（2）腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）隱球菌墨汁染色陰性；（3）合并活動性肺炎或肺外結(jié)核；（4）影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)顱底腦膜強(qiáng)化、腦積水或顱內(nèi)結(jié)核瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）病歷不全的患兒；（2）合并其他嚴(yán)重心、腎、肺等臟器疾病。另選取34例經(jīng)體檢正常排除TM的患兒為對照組，經(jīng)臨床檢查無肝、腎、腦和心臟等疾病。男19例，女15例；年齡8個月～6歲，平均（2.7±0.9）歲。2組患兒性別、年齡和基礎(chǔ)疾病等一般資料相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患兒及家屬簽字同意。

1.2 方法 FQ-PCR法：腦脊液標(biāo)本以1 500r／min離心5 min，棄上清液，沉淀物中加入50μL TB核酸提取液，輕彈管底3～5次，使沉淀物懸浮。將樣本管放置在30℃10min，隨后放置在4℃冷卻數(shù)分鐘。將樣本管10 000r／min離心5min，吸取上清，將反應(yīng)模板保存在4℃內(nèi)，取2μL模板上清液加入各自動反應(yīng)管供PCR用。結(jié)核分枝桿菌核酸擴(kuò)增熒光檢測試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供，F(xiàn)Q-PCR儀購自美國ABI公司。

涂片染色法：對腦脊液標(biāo)本離心，沉渣涂片抗酸染色，鏡檢找抗酸桿菌。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)整理和分析，計數(shù)資料行χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組檢出陽性率比較 2種方法檢出陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。FQ-PCR檢測對于TM的診斷具有更高的陽性檢出率。見表1。

表1 2組檢出陽性率比較

2.2 2種檢測方式對TM診斷的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值比較 2種方法敏感性和陰性預(yù)測值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。FQ-PCR檢測對TM具有更高的靈敏性。見表2。

表2 2種檢測方式對TM診斷的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值比較 （%）

3 討論

腦膜炎是一種腦膜或腦脊膜感染疾病，通常伴細(xì)菌或病毒感染。腦膜炎患者大多數(shù)為2歲以下嬰幼兒，多出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛和嘔吐、精神萎靡或愛哭鬧、頸部疼痛等。腦膜炎發(fā)病率、致死率和致殘率均相對較高，嚴(yán)重威脅患兒生命安全。且其發(fā)病機(jī)制和病理生理過程復(fù)雜，目前尚無統(tǒng)一的解釋［4］。腦膜炎早期臨床表現(xiàn)多樣化，且不典型，病情進(jìn)展迅速，診斷較為困難，常常在發(fā)生不可逆的神經(jīng)損傷后才被診斷出來。因此，腦膜炎的早期診斷對于其預(yù)后具有重要的價值。

在TM的診斷中，病原體的檢出為確診的金標(biāo)準(zhǔn)，目前常規(guī)的TB檢測方法為抗酸染色涂片法和培養(yǎng)法，抗酸染色涂片雖然簡便易行，但檢出率往往不高，報道顯示，檢出率5%～15%［5-6］。TB培養(yǎng)的檢出率雖然較高，然而其耗時較長，需要1～2個月才能達(dá)到預(yù)期效果，即便是快速檢測也需要1周以上，失去了TM早發(fā)現(xiàn)、早治療的良機(jī)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，PCR技術(shù)在方法學(xué)上的優(yōu)越性，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于結(jié)核病的診斷中［7］。常規(guī)PCR由于存在非特異性、易污染、檢測結(jié)果需要進(jìn)行溴化乙錠（EB，為強(qiáng)致癌物）染色等原因，造成一定的假陽性和假陰性。FQ-PCR克服了常規(guī)PCR的劣勢，通過加入熒光探針，將核酸擴(kuò)增、雜交和熒光光譜技術(shù)結(jié)合起來，從而提高了檢出率和敏感性［8］。理論上只要存在一個TB菌，便能將其檢測出來，具有簡便和快速的優(yōu)點，且自動化程度高，對環(huán)境污染小，適于實驗室應(yīng)用［9］。

本次研究我們通過對34例TM患兒采用FQ-PCR檢測TB-DNA水平，并與傳統(tǒng)的涂片染色法比較，發(fā)現(xiàn)FQ-PCR對TM的陽性檢出率明顯更高。本次研究還顯示，F(xiàn)Q-PCR法的敏感性和陰性預(yù)測值高于傳統(tǒng)結(jié)核涂片法，說明FQPCR在TM的診斷中具有一定的價值，而其敏感性仍有待提高，且當(dāng)TB-DNA陰性時也不能輕易排除TM的診斷。我們認(rèn)為，本次臨床確診TM患者CSF的TB-DNA陰性的原因主要有以下幾點：（1）TM患者中TB菌株的含量較少；（2）引物和探針設(shè)計未選取最佳的特異性保守片段，細(xì)菌DNA特異序列存在部分突變，DNA提取過程中可能出現(xiàn)降解，細(xì)胞壁的裂解不完全導(dǎo)致提取的DNA量非常少，不能滿足PCR擴(kuò)增模板濃度的要求；（3）患兒接受的抗結(jié)核治療起效，標(biāo)本選取時間滯后，本組12例患兒是在抗結(jié)核治療實施后才抽取的CSF，而抗結(jié)核效果顯著也是TB-DNA陰性的原因之一。針對FQ-PCR敏感性不高的問題，部分學(xué)者認(rèn)為可進(jìn)行連續(xù)多次PCR以提高敏感性和檢出率，從而提高診斷的可靠性。因此，臨床醫(yī)師在依據(jù)患者臨床癥狀和體征表現(xiàn)，高度懷疑患者為TM時，可進(jìn)行早期、連續(xù)的FQ-PCR以提高檢出率。

綜上所述，F(xiàn)Q-PCR對TM具有重要的診斷價值，敏感性高且特異性強(qiáng)，值得臨床進(jìn)一步推廣。但仍然需要尋找對TM更為敏感的診斷方式。

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