余玉銀唐省三李方成汪 凌梁淑燕程 彥

1）廣東同江醫(yī)院神經(jīng)外科 佛山 528300 2）廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院護(hù)理學(xué)院 廣州 510520 3）中山大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 廣州 510120 4）廣東佛山市順德區(qū)大良醫(yī)院 佛山 528300

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是最常見的運(yùn)動障礙且與老化相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病之一。約2%的60歲以上老人罹患此病，主要臨床表現(xiàn)是運(yùn)動障礙（運(yùn)動遲緩、震顫、姿勢不穩(wěn)、僵直）與非運(yùn)動相關(guān)癥狀（嗅覺缺失、自主反應(yīng)失調(diào)、認(rèn)知缺陷、抑郁和睡眠障礙）。有研究顯示，水通道蛋白（Aquaporin，AQP）9即AQP9參與了機(jī)體能量代謝及水電解質(zhì)調(diào)節(jié)［1-2］。目前，鮮有文獻(xiàn)報(bào)道帕金森病腦組織中AQP9的表達(dá)變化以及其對帕金森病的影響。因此，本研究旨在通過建立大鼠帕金森病模型，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)和免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IH）等實(shí)驗(yàn)方法，研究帕金森病大鼠腦組織中AQP9表達(dá)的變化情況，分析帕金森病不同階段中AQP9表達(dá)所發(fā)揮的作用，探索新的臨床治療帕金森病的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 選取成年廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供的64只Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量200～250g。動物分為正常組（n＝10）、假手術(shù)組（n＝27）和帕金森病組（n＝27）。假手術(shù)組和帕金森病組分別于術(shù)后1、2、3、4、5、6、8、10和12周取材。每一時(shí)間點(diǎn)，分別用IH及RT-PCR法檢測帕金森病組和假手術(shù)組大鼠3只。

1.2 PD大鼠模型制作及入選標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 PD大鼠模型制作：大鼠稱重并記錄后，向大鼠注射6%水合氯醛進(jìn)行麻醉；將大鼠固定在立體定位儀上，經(jīng)常規(guī)碘酒和酒精消毒后，取頭部正中矢狀位切開皮膚與皮下組織至顱骨。按照包新民等研究的大鼠腦圖譜確定黑質(zhì)及黑質(zhì)紋狀體通路注射坐標(biāo)位點(diǎn)，將新鮮配制的6-OHDA溶液4μL（6-OHDA含量為12μg）通過微量注射器緩慢勻速地注射到大鼠腦內(nèi)，退出微量注射器后立即縫合切口。動物蘇醒后，予以食水，送回動物飼養(yǎng)室。假手術(shù)組大鼠除不注射藥物6-OHDA外，其余操作同帕金森病組。

1.2.2 PD大鼠模型行為學(xué)檢測：大鼠術(shù)后1周，在注射6-OHDA的大鼠腹腔內(nèi)注射鹽酸阿撲嗎啡（5mL／kg），注射后5min后，觀察大鼠向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)的情況并使用大鼠帕金森病模型旋轉(zhuǎn)檢測儀予以記錄，連續(xù)記錄60min，旋轉(zhuǎn)標(biāo)準(zhǔn)為：大鼠向注射藥物的對側(cè)不改變方向地旋轉(zhuǎn)360°為旋轉(zhuǎn)1次。上述操作每周1次，連續(xù)檢測12周。PD大鼠模型制作成功標(biāo)準(zhǔn)為：大鼠平均旋轉(zhuǎn)次數(shù)≥7次／min。假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 制作腦組織切片：麻醉受試大鼠，生理鹽水心臟灌注后，斷頭取腦組織并立即進(jìn)行冰凍切片，按照厚約10μm／片標(biāo)準(zhǔn) 連續(xù)切片，晾干后做常規(guī)HE和IHC染色。

1.3.2 IHC檢測AQP9的表達(dá)變化：切片洗片后，按照SAP-9100（中杉金橋）免疫組化試劑盒的說明完成操作。使用水溶性封片劑進(jìn)行封片，并在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察及拍照。陰性對照組采用0.01mol／L PBS緩沖液代替一抗，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。

1.3.3 RT-PCR檢測AQP9mRNA含量的變化：對實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行麻醉，心臟灌注冰生理鹽水后斷頭取腦，選取帕金森組大鼠50mg病灶周圍腦組織，同時(shí)選取假手術(shù)組與正常組大鼠相應(yīng)部位50mg腦組織。按照Trizol試劑說明書（Takara公司生產(chǎn)）提取各受試大鼠的腦組織RNA，用紫外分光光度儀進(jìn)行檢測。mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA依照杭州博日AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明進(jìn)行。用AQP9（165bp）上游5′-gaaggacggtgccaagaag-3′，下游5′-gtgatgatcccgccaaaac-3′；B-actin（398bp）上 游5′-ctgccgcatcctcttcctc-3′，下 游5′-ctcctgcttg ctgatccacat-3′引物對AQP9及β-actin的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物含量采用2%瓊脂糖凝膠電泳法檢測，其結(jié)果通過紫外分析儀進(jìn)行觀察并照相。

1.3.4 圖像分析：在免光鏡下分析疫組化結(jié)果，使用北航CM-2000B型生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對隨機(jī)選取的同一部位切片10個(gè)不同視野進(jìn)行自動分析，細(xì)胞平均灰度值表示其結(jié)果；RT-PCR結(jié)果采用Bandscan5.0分析軟件進(jìn)行密度分析，AQP9mRNA的表達(dá)水平計(jì)算公式為：AQP9mRNA含量＝AQP9光密度值／β-actin光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦組織病理變化 選取的腦組織切片經(jīng)Nissl染色，帕金森病組成功模型鼠左側(cè)黑質(zhì)致密部（SNC）及中腦腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）區(qū)可見到神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，顆粒密度減少，內(nèi)氏體模糊，伴有少量反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生，損毀范圍以注射點(diǎn)為中心向周邊擴(kuò)散，在靠近前囟后5.2mm的切片上顯示SNC區(qū)損毀面積達(dá)1.87mm×0.26mm，占SNC總面積的94%，右側(cè)SNC及VTA區(qū)神經(jīng)元未見明顯減少，顆粒密度分布正常，內(nèi)氏體清晰。而正常組及假手術(shù)組雙側(cè)SNC及VTA區(qū)神經(jīng)元數(shù)目未見異常。

2.2 AQP9在不同組別中表達(dá)比較 IHC結(jié)果顯示，正常組雙側(cè)大腦皮質(zhì)、下丘腦、海馬、左側(cè)黑質(zhì)致密部（SNC）及中腦腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）區(qū)AQP9表達(dá)呈弱陽性，假手術(shù)組各時(shí)段與正常組基本一致，但帕金森病組AQP9表達(dá)則呈現(xiàn)動態(tài)性變化過程：術(shù)后1周，病灶側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬、左側(cè)黑質(zhì)致密部（SNC）及中腦腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）區(qū)、室管膜、脈絡(luò)叢、下丘腦室旁核和視上核AQP9表達(dá)較假手術(shù)組強(qiáng)，差異存在顯著性（P＜0.05）；術(shù)后2～5周，帕金森病組AQP9表達(dá)逐漸降低，至4周降至最低，均低于同一時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組AQP9表達(dá)水平（P＜0.05），僅脈絡(luò)叢可見較強(qiáng)表達(dá)；6周后雙側(cè)大腦AQP9廣泛表達(dá)，AQP9表達(dá)在黑質(zhì)致密部及中腦腹側(cè)被蓋區(qū)、大腦皮質(zhì)、脈絡(luò)膜、雙側(cè)室管膜、穹窿下器等腦室周圍器官、背側(cè)丘腦、海馬、病灶中心區(qū)及周圍組織、下丘腦室旁核、視上核等部位均可見，8周尤為明顯，顯著高于同一時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組AQP9表達(dá)水平（P＜0.05）；隨后AQP9表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢，但于12周時(shí)，其表達(dá)水平仍明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），詳見圖1。

圖1 帕金森病腦組織中AQP9的表達(dá)變化

2.3 各組AQP9mRNA含量變化 正常組、假手術(shù)組和帕金森病組大鼠病灶周圍腦組織是本實(shí)驗(yàn)AQP9mRNA含量的檢測對象。RT-PCR結(jié)果顯示：假手術(shù)組AQP9mRNA含量與正常組比較，差異無顯著性；帕金森病組AQP9mRNA的表達(dá)則呈現(xiàn)動態(tài)性變化過程：術(shù)后1周，帕金森病組大鼠腦組織AQP9mRNA含量已明顯高于假手術(shù)組含量（P＜0.05）；隨后，該組AQP9mRNA含量呈逐漸下降趨勢，于4周時(shí)降至最低值，明顯低于同一時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組AQP9mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）；之后，AQP9mRNA含量又逐漸升高，自術(shù)后5～12周各時(shí)段，AQP9mRNA含量均明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），并于8周達(dá)到峰值，隨后呈現(xiàn)下降趨勢，但12周時(shí)，AQP9mRNA含量仍明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），詳見圖2。

圖2 帕金森病腦組織中AQP9mRNA的表達(dá)變化（RT-PCR）

3 討論

水通道蛋白即水孔蛋白，是一組與水通透有關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。自1988年發(fā)現(xiàn)第一個(gè)水通道蛋白后，從哺乳動物組織內(nèi)相繼分離克隆出至少13種AQP［3］。目前，在腦組織中發(fā)現(xiàn)6種AQP蛋白，它們分別是AQP1、3、4、5、8和9［4］。AQP9作為水通道蛋白一種特殊亞型，具有廣泛通透性，既具有水通透性，還對多元醇、尿素、嘧嘌呤City、啶類、單羧基類等中性溶質(zhì)以及類金屬物質(zhì)都具有很好的轉(zhuǎn)運(yùn)活性［5-6］。脂肪組織中最早發(fā)現(xiàn)AQP9的存在，隨后在白細(xì)胞、肝臟、睪丸、腦和脾等組織中也有發(fā)現(xiàn)［7］。目前對AQP9在腦組織的認(rèn)識尚處于起步階段，鮮見相關(guān)報(bào)道。

學(xué)術(shù)界一直認(rèn)為PD發(fā)病與環(huán)境因素密切相關(guān)，特別是環(huán)境中一些殺蟲劑、除草劑以及銅、錳、鉛等金屬元素可能導(dǎo)致PD的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)腦多巴胺神經(jīng)元線粒體內(nèi)膜上AQP9呈現(xiàn)陽性表達(dá)［8］，中毒的主要靶點(diǎn)在線粒體，AQP9在腦組織中不僅與維持水代謝平衡有關(guān)，而且在能量代謝方面發(fā)揮著重要作用［9］，因此推測AQP9可能與PD發(fā)病有一定的關(guān)聯(lián)，但目前尚缺乏對兩者相關(guān)性及作用機(jī)制的明確認(rèn)識。

本實(shí)驗(yàn)使用大鼠腦圖譜確定黑質(zhì)及黑質(zhì)紋狀體通路注射位點(diǎn)坐標(biāo)方法制造帕金森病模型。帕金森病組腦組織切片經(jīng)Nissl染色，可見帕金森病組成功模型鼠左側(cè)黑質(zhì)致密部（SNC）與中腦腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）區(qū)神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，顆粒密度減少，內(nèi)氏體模糊，伴少量反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生，說明帕金森病動物模型制造成功。本研究發(fā)現(xiàn)，帕金森病組AQP9和AQP9mRNA的表達(dá)則呈一動態(tài)性變化過程：術(shù)后1周，AQP9強(qiáng)表達(dá)于病灶側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬、左側(cè)黑質(zhì)致密部（SNC）及中腦腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）區(qū)、脈絡(luò)叢、室管膜、下丘腦視上核及室旁核（P＜0.05）；術(shù)后2～5周，AQP9表達(dá)呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，至4周時(shí)其值達(dá)到最低，均低于同一時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組AQP9表達(dá)水平（P＜0.05），僅脈絡(luò)叢可見較強(qiáng)表達(dá)；6周后雙側(cè)大腦廣泛表達(dá)AQP9，8周尤為明顯，顯著高于同一時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組AQP9表達(dá)水平（P＜0.05）；隨后AQP9表達(dá)呈現(xiàn)減弱趨勢，但于12周時(shí)，其表達(dá)水平仍明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）。由此推測，此期高表達(dá)的AQP9，主要通過調(diào)節(jié)水電解質(zhì)和能量代謝，從而在帕金森病發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

綜上所述，術(shù)后2周帕金森病組出現(xiàn)AQP9及其mRNA表達(dá)降低現(xiàn)象，在細(xì)胞間液急劇增加的情況下，通過延遲形成細(xì)胞內(nèi)水腫，發(fā)揮保護(hù)膠質(zhì)細(xì)胞的作用；隨后，AQP9及其mRNA表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，提示可能與機(jī)體出現(xiàn)水電解質(zhì)平衡和能量代謝失調(diào)有關(guān)。目前，醫(yī)學(xué)界對帕金森病鼠腦AQP9研究還處于初始階段，相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究還需要進(jìn)一步探索。

［1］Rojek AM，Skow ronskiM T，F(xiàn)uchtbauer EM，et al.Defective glycerol metabolism in aquaporin 9（AQP9）knockout mice［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（9）：3 609-3 614.

［2］Badaut J，Brunet JF，Petit JM，et al.Induction of brain aquaporin 9（AQP9）in catecholam inergic neurons in diabetic rats［J］.Brain Res，2008，1 188：17-24.

［3］Magni F，Sarto C，Ticozzi D，et al.Proteomic knowledge of human aquaporins［J］.Proteomics，2006，6（20）：5 637-5 649.

［4］Badaut J，Lasbennes F，Magistretti PJ，et al.Aquaporins in brain：distribution，physiology，and pathophysiology［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2002，22（4）：367-378.

［5］Badaut J，Brunet JF，Regli L.Aquaporins in the brain：from aqueduct to"multi-duct"［J］.Metab Brain Dis，2007，22（3-4）：251-263.

［6］Leung J，Pang A，Yuen WH，et al.Relationship of expression of aquaglyceropor in 9with arsenic uptake and sensitivity in leukem ia cells［J］.Blood，2007，109（2）：740-746.

［7］Elkjaer M，Vajda Z，Nejsum LN，et al.Immunolocalization of AQP9in liver，epididymis，testis，spleen，and brain［J］.Biochem Biophys Res Commun，2000，276（3）：1 118-1 128.

［8］Tait MJ，Saadoun S，Bell BA，et al.Water movements in the brain：role of aquaporins［J］.Trends Neurosci，2008，31（1）：37-43.

［9］Amiry-Moghaddam M，Lindland H，Zelenin S，et al.Brain mitochondria contain aquaporin water channels：evidence for the expression of a short AQP9isoform in the inner mitochondrial membrane［J］.FASEB J，2005，19（11）：1 459-1 467.