王 瀟 ， 王秀敏 ， 管慶豐 ， 滕 達(dá) ， 姚軍虎 ， 王建華 *

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京海淀100081；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所基因工程研究室，北京海淀 100081）

多種革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、志賀氏菌及沙門氏菌等均為飼料中常見病原菌，會(huì)引發(fā)腹瀉、敗血癥等疾?。ㄖ軙郧?，2012）。常規(guī)抗菌劑或者抗菌藥多具廣譜抗菌性，對(duì)正常菌群也有很強(qiáng)抑制效果，無(wú)差別性殺菌容易破壞腸道微生態(tài)環(huán)境，使機(jī)體遭受二次感染（Mao等，2012）。而靶向抗菌劑能選擇性殺滅目標(biāo)菌，對(duì)正常細(xì)菌無(wú)作用或作用較?。ɑ酐惗潞土杈鶙ぃ?009）。特異性靶向定位區(qū)對(duì)靶向抗菌劑的靶向效應(yīng)具有結(jié)構(gòu)決定作用。單鏈抗體可變區(qū)片段 （scFv）是輕鏈 （VL）和重鏈（VH）可變區(qū)通過(guò)（Gly4Ser）3 linker連接而成的具有抗原親和力的抗體片段，是靶向抗菌劑特異性靶向定位區(qū)的理想候選物之一（Pan等，2012；Ahmad 等，2012）。

外膜蛋白C（OmpC）在多種革蘭氏陰性菌膜上均有分布，具有運(yùn)輸疏水性分子等生理機(jī)能，為耐藥性關(guān)聯(lián)蛋白，且能引發(fā)機(jī)體強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)并產(chǎn)生特異性抗體 （Liu等，2012a、b）。 核糖體展示技術(shù)是將抗體庫(kù)體外轉(zhuǎn)錄翻譯并在完成后阻止mRNA及蛋白脫落，形成蛋白質(zhì)、核糖體與mRNA分子聚合物，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)親和篩選獲得與靶抗原具有高親和性的單鏈抗體序列的過(guò)程（Plückthun，2012）。 近年來(lái)核糖體展示技術(shù)由于克服了基因庫(kù)的轉(zhuǎn)化丟失及胞內(nèi)難以表達(dá)毒性蛋白的限制，作為一種篩選容量大、多樣性好的方式，已成功用于抗體、酶及其他蛋白的篩選（Sun等，2012）。在核糖體展示中，構(gòu)建高質(zhì)量、大容量scFv庫(kù)是保證篩選出高親和力抗體可變區(qū)序列的關(guān)鍵。scFv具有分子量小、組織穿透力強(qiáng)，且含有決定抗體與抗原特異性的結(jié)構(gòu)，在抗原物質(zhì)檢測(cè)和藥物設(shè)計(jì)方面具有極高的參考價(jià)值。本課題組前期工作已完成大腸桿菌OmpC的原核重組表達(dá)（待發(fā)表），本研究將其作為抗原蛋白開展了相關(guān)工作，PCR構(gòu)建核糖體展示抗體庫(kù)，篩得抗OmpC蛋白的特異性scFv，旨在為構(gòu)建飼料有害革蘭氏陰性菌的預(yù)警檢測(cè)及靶向抗菌劑和關(guān)聯(lián)藥物的靶向定位區(qū)設(shè)計(jì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 純化的重組大腸桿菌外膜蛋白OmpC（C端帶有6×His標(biāo)簽）由本實(shí)驗(yàn)室制備；Taq DNA聚合酶、EasyPfu高保真DNA聚合酶、DNA marker，均購(gòu)自全式金生物科技有限公司；TRIZOL、逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒，均購(gòu)自TaKaRa公司；PCR產(chǎn)物純化和膠回收試劑盒，均購(gòu)自天根生化科技有限公司。引物由上海生工公司合成；DNA測(cè)序服務(wù)由上海生工公司提供。6～8周齡雌性BALB／c小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大腸桿菌外膜蛋白OmpC免疫小鼠和骨髓細(xì)胞制備 將OmpC蛋白 （純度為96%）免疫3只6～8周齡雌性BALB／c小鼠。初次免疫佐劑為完全弗氏佐劑，皮下注射；初次免疫3周后進(jìn)行二免，佐劑為不完全弗氏佐劑，腹腔注射；2周后進(jìn)行三免，免疫方式同二免。蛋白免疫劑量為25 μg/只[（25 μg 蛋白溶于 25 μL 磷酸鹽緩沖液（PBS），加入25 μL免疫佐劑及50 μL PBS，移液器吹打乳化后 100 μL/只免疫）]。

免疫后6 d，脫頸處死小鼠。將小鼠脛骨和股骨上的肌肉和脂肪去除，并用外科手術(shù)剪減掉兩端，用20 mL PBS沖洗，收集于50 mL離心管中。收集的骨髓組織用70 μm濾膜過(guò)濾，離心10 min（4 ℃，335 g），棄上清，將沉淀重懸于 3 mL 紅細(xì)胞裂解液中，25℃輕柔搖動(dòng)5 min。向細(xì)胞重懸液中加入 20 mL PBS，4℃、335 g離心 10 min， 棄上清，將沉淀重懸于1 mL PBS中。將上一步得到的重懸液于4℃、930 g離心5 min，獲得小鼠骨髓細(xì)胞。

1.2.2 OmpC免疫小鼠骨髓細(xì)胞總RNA的提取及其cDNA逆轉(zhuǎn)錄 按TRIZOL法提取細(xì)胞總RNA（朱姜，2008）。按照 TaKaRa RNA PCR Kit說(shuō)明書，利用隨機(jī)引物Oligo（dT）l5將小鼠骨髓細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（孟夏萌，2008）。

1.2.3 元件、引物的設(shè)計(jì)與合成 元件合成見表1：（1）含有T7啟動(dòng)子、5'端莖環(huán)結(jié)構(gòu)與核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（Shine Dalgarno，SD）的 scFv 上游元件序列。 （2）含有6His myc標(biāo)簽、gⅢ tether和 3'端莖環(huán)結(jié)構(gòu)的scFv下游元件序列。

表1 構(gòu)建核糖體展示文庫(kù)合成元件

引物設(shè)計(jì)見表2：（1）用于擴(kuò)增抗體庫(kù)VL和VH 的 引 物 ：VHF、VHR、VLF 和VLR （Luo 和 Xia，2012）。 （2）用于擴(kuò)增帶有（Gly4Ser）3 linker的 VH和VL序列的引物：VH+linker R和VL+linker F。重鏈下游引物及輕鏈上游引物均帶有l(wèi)inker序列，以便通過(guò)重疊延伸PCR合成帶有l(wèi)inker序列的scFv基因。（3）用于在VL基因下游連接帶有6His標(biāo)簽的堿基序列，便于鑒定和純化的引物：HisRev VLR。（4）重疊延伸獲得連接gⅢ tether及最終序列的引物：T7B和T6te。

1.2.4 構(gòu)建核糖體展示文庫(kù) 核糖體展示元件構(gòu)建示意如圖1所示：（1）以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，以 VHF、VHR，VLF、VLR 為引物分別進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 VH、VL 基因；（2）將引物 VHF、VH+linker R，VLF、VL+linker F分別混合，以VH、VL基因?yàn)槟０?，PCR獲得VH+linker序列和VL+linker序列，用膠回收試劑盒純化；（3）將等物質(zhì)的量濃度的純化產(chǎn)物VH+linker和VL+linker混合，利用引物VHF和VLR進(jìn)行重疊延伸PCR，將VH與VL通過(guò)linker連接獲得scFv基因庫(kù)，用膠回收試劑盒純化；（4）以引物VHF和HisRev VLR對(duì)scFv基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得帶6His標(biāo)簽的scFv序列，用膠回收試劑盒純化；（5）將等物質(zhì)的量濃度的純化產(chǎn)物scFv（帶有6His標(biāo)簽）與gⅢ tether混合，利用引物VHF和T6te進(jìn)行重疊延伸PCR，獲得連接gⅢtether及3'端莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列；（6）純化所獲序列與T7SD序列等物質(zhì)的量濃度混合，利用引物T7B和T6te進(jìn)行重疊延伸PCR反應(yīng)，最后獲得完整序列（圖1）。

表2 構(gòu)建核糖體展示文庫(kù)引物序列

圖1 核糖體展示元件的構(gòu)建過(guò)程

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR法獲得抗體庫(kù)VH、VL及其連接linker序列 本課題組前期研究表明，大腸桿菌OmpC蛋白免疫BALB/c小鼠后所產(chǎn)生抗體對(duì)OmpC蛋白的效價(jià)高達(dá)1∶240000，對(duì)大腸桿菌菌體效價(jià)高達(dá)1∶27000，說(shuō)明免疫小鼠能產(chǎn)生高親和力抗體，且部分抗體可特異性結(jié)合于菌體表面蛋白區(qū)域，初步實(shí)證了scFv作為飼料中革蘭氏陰性病原菌檢測(cè)物質(zhì)和靶向抗菌藥物靶向定位區(qū)的可行性（Wang等，待發(fā)表）。此外，研究發(fā)現(xiàn)小鼠免疫6 d后，會(huì)有高濃度骨髓漿細(xì)胞產(chǎn)生，并在骨髓中較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定（Reddy等，2010）。因此，小鼠免疫后第6天提取小鼠骨髓細(xì)胞總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得抗體可變區(qū)cDNA序列，以此為模板，以 VHF、VHR，VLF、VLR 為引物擴(kuò)增 VH、VL 序列（圖 2）。

圖2 PCR擴(kuò)增獲得抗體重鏈、輕鏈可變區(qū)及其連接linker序列

為保證抗體庫(kù)多樣性，VH上游用簡(jiǎn)并引物，且VH、VL上下游引物均依據(jù)抗體可變區(qū)框架區(qū)設(shè)計(jì)（Luo 和 Xia，2012；Reddy 等，2010）。 最終獲得VH片段大小約為350 bp，VL片段大小約為700 bp（圖 2）， 與 Lee等 （2004） 報(bào)道相符。（Gly4Ser）3柔韌性很強(qiáng)，不會(huì)對(duì)抗體可變區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)及肽鏈折疊產(chǎn)生影響，具有維持天然抗體特異性結(jié)合性質(zhì)的作用，其被作為linker廣泛用于scFv庫(kù)的構(gòu)建。故隨后以VH、VL基因?yàn)槟０澹訴HF、VH+linker R，VLF、VL+linker F 為引物，PCR擴(kuò)增后獲得VH+linker和VL+linker序列 （圖2）（Luo 和 Xia，2012）。

2.2 重疊延伸 PCR構(gòu)建 VH+linker+VL（scFv）和VH+linker+VL+6His myc（scFv-6His myc）序列將膠回收純化的VH+linker和VL+linker序列等物質(zhì)的量濃度混合，利用引物VHF和VLR進(jìn)行重疊延伸PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見，VH與VL基因通過(guò)linker連接獲得scFv基因，即VH+linker+VL序列，片段大小約為1000 bp。以切膠回收純化的scFv基因?yàn)槟０澹肰HF和His-Rev VLR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得帶有6His標(biāo)簽的scFv序列（scFv-6His）。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，普通PCR和重疊延伸PCR效率都不高，非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象明顯，需要反復(fù)多次PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳后“切膠-回收-純化”富集目的序列。這可能與上、下游引物及文庫(kù)中scFv基因序列中的高GC含量有關(guān)（陳銳，2009）。

圖3 重疊延伸PCR和PCR獲得VH+linker+VL序列和VH+linker+VL+6His序列

圖4 重疊延伸PCR獲得VH+linker+VL+6His myc+gⅢ tether+3'loop序列和T7+5'loop+SD+VH+linker+VL+6His myc+gⅢ tether+3'loop序列

2.3 核糖體展示篩選高親和力scFv序列文庫(kù)的構(gòu)建 核糖體展示中，完整的元件構(gòu)建決定其體外轉(zhuǎn)錄翻譯效果。首先，為使展示蛋白更好地折疊，并與抗原蛋白結(jié)合，翻譯完成后完整蛋白需脫離核糖體但不能脫落，故展示蛋白基因C端需融合一段非結(jié)構(gòu)蛋白基因“tether”，由此特殊肽段錨定核糖體。此外，為防止mRNA降解，在3'及5'端添加莖環(huán)結(jié)構(gòu)，能夠?qū)⒄故拘侍岣呒s15倍（Plückthun，2012）。 將 scFv-6His序列做膠回收純化后與合成的gⅢtether元件等物質(zhì)的量濃度混合，利用引物VHF和T6te做重疊延伸PCR，獲得scFv+6His myc+gⅢtether+5'loop序列，約1300 bp（圖4）。在體外轉(zhuǎn)錄過(guò)程中還需要強(qiáng)啟動(dòng)子（T7）以高效獲得RNA及SD序列以保證翻譯過(guò)程順利進(jìn)行。故將所得序列膠回收純化后與合成的T7SD元件等物質(zhì)的量濃度混合，并利用引物T7B和T6te進(jìn)行重疊延伸PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示獲得完整核糖體展示序列，約1420 bp（圖4）。在此過(guò)程中非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象更加嚴(yán)重，或與兩端莖環(huán)結(jié)構(gòu)有關(guān)，在重疊延伸PCR連接T7SD和gⅢtether過(guò)程中引物設(shè)計(jì)必須在莖環(huán)結(jié)構(gòu)部分，這也可能是造成擴(kuò)增效率不高的原因之一。在擴(kuò)增過(guò)程中嘗試通過(guò)改變引物堿基數(shù)目改進(jìn)，但效果不佳。最終采取多次擴(kuò)增、切膠回收的方式獲得抗體庫(kù)。

3 結(jié)論

OmpC蛋白免疫BALB/c小鼠，獲得骨髓漿細(xì)胞。以其總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得 VH和 VL， 并通過(guò)（Gly4Ser）3 linker連接兩片段，獲得scFv庫(kù)。通過(guò)重疊延伸PCR法添加T7啟動(dòng)子、SD、gⅢ tether和兩端莖環(huán)結(jié)構(gòu)等元件，最終成功構(gòu)建針對(duì)大腸桿菌外膜蛋白C單鏈抗體核糖體展示文庫(kù)。為進(jìn)一步通過(guò)核糖體展示法篩選高特異性、高親和力scFv抗體奠定了基礎(chǔ)，為飼料和其他領(lǐng)域革蘭氏陰性病原菌檢測(cè)及靶向抗菌劑和關(guān)聯(lián)藥物的靶向定位區(qū)的分子設(shè)計(jì)提供了新思路，也為其他關(guān)聯(lián)領(lǐng)域scFv抗體的制備提供了參考方法和材料基礎(chǔ)。

[1]陳銳.核糖體展示人源性scFv文庫(kù)的構(gòu)建及篩選抗人LBP抗體的局限性分析：[博士學(xué)位論文][D].重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)，2009.

[2]霍麗堵，凌均棨.特異性靶向抗菌肽的抗變異鏈球菌作用[J].國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2009，36（5）：550～553.

[3]孟夏萌.運(yùn)用核糖體展示技術(shù)篩選SEB抗體的初步研究：[碩士學(xué)位論文][D].天津：天津醫(yī)科大學(xué)，2008.

[4]周曉清.食源性沙門氏菌的PCR快速檢測(cè)技術(shù)研究：[碩士學(xué)位論文][D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[5]朱姜.核糖體展示ScFv文庫(kù)的構(gòu)建及使用核糖體展示技術(shù)篩選壬基酚抗體：[碩士學(xué)位論文][D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2008.

[6]王瀟.大腸桿菌組疫苗設(shè)計(jì).免疫機(jī)理研究及抗體核糖體展示文庫(kù)構(gòu)建：[碩士論文][D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2015.

[7]Ahmad Z A，Yeap S K，Ali A M，et al.ScFv antibody：principles and clinical application[J].Clinical and Developmental Immunology，2012：980250.

[8]Luo Y，Xia Y.Selection of single-chain variable fragment antibodies against fenitrothion by ribosome display[J].Anal Biochem，2012，421（1）：130～137.

[9]Liu Y F，Yan J J，Lei H Y，et al.Loss of outer membrane protein C in Escherichia coli contributes to both antibiotic resistance and escaping antibodydependent bactericidal activity[J].Infect.Immun，2012a，80（5）：1815～1822.

[10]Liu C，Chen Z，Tan C，et al.Immunogenic characterization of outer membrane porins OmpC and OmpF of porcine extraintestinal pathogenic Escherichia coli[J].FEMS Microbiol Lett，2012b，337（2）：104～111.

[11]Lee M S，Kwon M H，Kim K H，et al.Selection of scFvs specific for HBV DNA polymeraseusing ribosome display[J].J.Immunological Methods，2004， 284（1）：147～157.

[12]Plückthun A.Ribosome display：a perspective[J].Methods Mol Biol，2012，805：3～28.

[13]Mao R Y，Teng D，Wang X M，et al.Design，expression and characterization of a novel targetedplectasin against methicillin-resistantStaphylococcus aureus[J].Appl Microbiol Biotechnol，2012，97（9）：3991～4002.

[14]Pan Y，Mao W，Liu X，et al.Selection of single chain variable fragments specific for the human-inducible costimulator using ribosome display[J].Appl Biochem Biotechnol，2012，168（5）：967～979.

[15]Reddy S T，Ge X，Miklos A E，et al.Monoclonal antibodies isolated without screening by analyzing the variable-gene repertoire of plasma cells[J].Nat Biotechnol，2010，28（9）：965～969.

[16]Sun Y，Ning B，Liu M，et al.Selection of diethylstilbestrol-specific singlechain antibodies from a non-immunized mouse ribosome display library[J].PLoS One，2012，7（3）：33186.

[17]Wang X，Guan Q F，Wang X M，et al.Paving the way to construct a new vaccine against Escherichia coli from its recombinant outer membrane protein C via model mouse，Process Biochemistry，Manuscript Number: