潘春梅， 李彥紅， 袁麗娟

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院生物工程系，河南鄭州 450046；2.鄭州大學化學與分子工程學院，河南鄭州 450052；3.鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測流通中心，河南鄭州 450006）

動物血液中蛋白質(zhì)含量高，可作為畜禽蛋白質(zhì)飼料來源。但是由于加工成本高，設(shè)備不配套以及血粉中蛋白質(zhì)分子量大、難消化、適口性差等原因，造成血粉資源大量浪費，而且嚴重污染環(huán)境（方俊等，2006）。目前利用微生物發(fā)酵方法對血粉進行處理，可不同程度解決血粉消化率低、氨基酸平衡性差、功能單一等問題。如能利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，利用益生菌將血粉進行微生物發(fā)酵，在提高其蛋白消化利用率和適口性的同時，增加益生菌的數(shù)量，制備高效的高蛋白微生態(tài)血粉，對于改善動物的健康狀況有著重要意義。因此，本試驗選擇具有較高蛋白酶活力和顯著益生特性的納豆芽孢桿菌作為發(fā)酵菌株，利用響應(yīng)面方法對微生態(tài)血粉的發(fā)酵工藝參數(shù)進行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 菌種 納豆芽孢桿菌 （Bacillus natto ZZ18）由河南牧業(yè)經(jīng)濟學院微生物實驗室分離保存。

1.2 原料 血粉由河南君安生物科技有限公司提供，豆粕粉由鄭州天宇飼料科技有限公司提供，粗蛋白質(zhì)含量分別為79.3%、43.2%。

1.3 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，裝液量為50 mL/250 mL三角瓶，121℃滅菌15 min。血粉發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖 10，玉米粉 10，血粉 100，豆粕粉10，初始pH自然，裝液量50 mL/250 mL三角瓶，115℃滅菌30 min。

1.4 試驗方法

1.4.1 發(fā)酵培養(yǎng) 接一環(huán)已經(jīng)活化的納豆芽孢桿菌至種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。將擴大培養(yǎng)過的納豆芽孢桿菌加入到滅菌后的血粉發(fā)酵培養(yǎng)基中，在一定條件下恒溫振蕩培養(yǎng)72 h。取出培養(yǎng)液，測定細菌總數(shù)、游離氨基酸含量、可溶性蛋白質(zhì)含量，并計算水解度。每個樣品做3個平行樣。

1.4.2 發(fā)酵優(yōu)化試驗設(shè)計 采用Box-Benhnken試驗設(shè)計對發(fā)酵條件進行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗，包括12個析因試驗和3個中心試驗。以發(fā)酵溫度（X1）、接種量（X2）、搖床轉(zhuǎn)速（X3）為自變量，經(jīng)過下述公式分別進行編碼轉(zhuǎn)換：X1=（X1-34）/4；X2=（X2-6）/2；X3=（X3-180）/40。響應(yīng)面優(yōu)化回歸分析模型為：

式中：β0、βi、βii和 βij分別是截距及回歸系數(shù)；xi、xj是編碼轉(zhuǎn)換后的自變量；響應(yīng)值Y為血粉的水解度。試驗設(shè)計見表1和表2，利用Minitab軟件對響應(yīng)值和自變量之間的關(guān)系進行擬合統(tǒng)計分析。

表1 中心組合試驗設(shè)計的因素與水平

表2 中心組合試驗設(shè)計安排及不同發(fā)酵條件下血粉的水解度

1.4.3 水解度的測定 取血粉發(fā)酵液10 mL，加入質(zhì)量分數(shù)10%三氯乙酸10 mL，混勻后靜置30 min，4℃、10000 r/min離心 15 min，半微量凱氏定氮法測定上清液中三氯乙酸（TCA）可溶氮含量。分別測定血粉發(fā)酵前總氮含量以及發(fā)酵前后可溶性氮含量，按以下公式進行計算：

水解度 （DH）/%=（發(fā)酵后的可溶性氮含量-發(fā)酵前的可溶性氮含量）/發(fā)醇前總氮含量×100。

1.4.4 游離氨基酸總量的測定 采用茚三酮法測定游離氨基酸總量（龐偉，2009）。

1.4.5 蛋白酶活性測定 蛋白酶活性采用Folin酚法測定，酶活定義為1 mL酶液在40℃、pH 7.2條件下，每分鐘水解酪蛋白釋放出1 μg酪氨酸所需的酶量為1個活力單位（龐偉，2009）。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆芽孢桿菌發(fā)酵血粉工藝條件的響應(yīng)面優(yōu)化 在納豆芽孢桿菌發(fā)酵血粉的過程中，發(fā)酵溫度、接種量和轉(zhuǎn)速都會影響納豆芽孢桿菌的生長和血粉的水解。利用Box-Benhnken試驗設(shè)計研究發(fā)酵溫度（X1）、接種量（X2）、轉(zhuǎn)速（X3）對納豆芽孢桿菌血粉發(fā)酵水解度的影響。利用統(tǒng)計軟件MINITAB14.11對血粉水解度DH（表2）進行二次多項回歸擬合和數(shù)據(jù)分析，建立最佳血粉發(fā)酵條件的二次響應(yīng)面回歸模型。由表3可知，擬合的三元二次方程為：

式中：X1、X2和X3分別代表發(fā)酵溫度、接種量和搖床轉(zhuǎn)速的編碼水平；Y1代表血粉水解度預(yù)測值。

為檢驗方程的有效性，對血粉水解度的數(shù)學模型進行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，一次項 X1、X3極顯著（P ＜ 0.01），X2不顯著，表明發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速對血粉的水解具有較大的影響。二次項中 X12、X22、X32均具有顯著差異（P ＜ 0.1）。 交互項X1X2、X1X3、X2X3均不顯著，說明發(fā)酵溫度和接種量、發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速、轉(zhuǎn)速和接種量的交互作用對發(fā)酵血粉無顯著影響。

為檢驗方程的有效性，對水解度DH的數(shù)學模型進行方差分析，結(jié)果見表4。由表4可知，二次回歸模型的F值為15.06，相應(yīng)的概率值P＜0.004，模型決定系數(shù)R2=0.964，表明該模型回歸顯著，說明該模型對試驗結(jié)果擬合程度較好，試驗誤差小，預(yù)測值和實測值之間具有高度的相關(guān)性，較好地反映了血粉水解度DH與發(fā)酵溫度、接種量、轉(zhuǎn)速的關(guān)系，因此可以用此模型對納豆芽孢桿菌發(fā)酵血粉水解度進行分析和預(yù)測。

表3 Box-Benhnken試驗對血粉水解度的回歸分析結(jié)果

表4 血粉水解度回歸方程的方差分析

為了求得發(fā)酵血粉的最佳培養(yǎng)條件，對所得的回歸擬和方程分別對各自的變量求一階偏導(dǎo)，并令其為0，得到三元一次方程組，求解此方程組得出該模型的極值點：X1=0.6449、X2=0.1309、X3=0.5532、Y=29.2，即當發(fā)酵溫度36.6℃、接種量6.6%和轉(zhuǎn)速為202 r/min時，發(fā)酵血粉的理論最大DH值為29.2%。

根據(jù)獲得的回歸方程，利用Minitab繪出不同發(fā)酵條件下發(fā)酵血粉水解度的響應(yīng)面分析圖及其等高線圖，見圖1至圖3。每個響應(yīng)面分別代表兩個獨立變量之間的相互作用，此時第三個變量保持在最佳值水平，由響應(yīng)面圖可以看出：所有的響應(yīng)面圖均呈現(xiàn)明顯的峰值，這意味著最佳的發(fā)酵條件在試驗設(shè)計的考察范圍內(nèi)，其中溫度對發(fā)酵血粉水解度的影響最為顯著，當轉(zhuǎn)速和接種量固定在最佳水平時，發(fā)酵溫度在30～36.6℃，發(fā)酵血粉的水解度隨著發(fā)酵溫度的升高而顯著提高，當溫度高于36.6℃時，水解度降低。當發(fā)酵溫度和接種量固定在最佳水平時，轉(zhuǎn)速由140 r/min增至202 r/min，發(fā)酵血粉的水解度則隨之提高。這是因為在適當?shù)陌l(fā)酵溫度和溶氧水平下，納豆芽孢桿菌能產(chǎn)生較高活力的蛋白酶，將血粉蛋白中的高分子物質(zhì)水解。同時，由相應(yīng)的等高線圖可以看出，在圖1至圖3中的等高線圖接近圓形，交互作用均不顯著。

圖1 溫度和轉(zhuǎn)速對發(fā)酵血粉水解度的影響（接種量固定為6.6%）

圖2 接種量和轉(zhuǎn)速對發(fā)酵血粉水解度的影響（溫度固定為36.6℃）

圖3 接種量和溫度對發(fā)酵血粉水解度的影響（轉(zhuǎn)速固定為202 r/min）

2.2 納豆芽孢桿菌發(fā)酵血粉最佳發(fā)酵條件驗證試驗 根據(jù)求得的最優(yōu)回歸方程和試驗結(jié)果，得到發(fā)酵血粉水解度達最大值時的組合為：發(fā)酵溫度36.6℃、接種量6.6%和轉(zhuǎn)速為202 r/min。在此優(yōu)化條件下進行驗證試驗，搖瓶培養(yǎng)試驗測得的數(shù)據(jù)為29.1%±0.2%（n=5），試驗值與理論預(yù)測值非常接近，可見該模型可以較好地預(yù)測實際發(fā)酵情況，從而也證明了響應(yīng)面法優(yōu)化血粉發(fā)酵條件的可行性。

2.3 發(fā)酵血粉的組分分析 血粉與玉米粉、豆粕粉等混合物料經(jīng)納豆芽孢桿菌發(fā)酵后，發(fā)酵液外觀為淡紅色，具有發(fā)酵血液特殊醇香，無明顯血腥味和不良異味，室溫下保存6個月不變質(zhì)。經(jīng)納豆芽孢桿菌發(fā)酵后，發(fā)酵液中可溶性氮含量由發(fā)酵前的0.35 g/L增加至4.24 g/L，游離氨基酸含量由發(fā)酵前的0.17 g/L增加至1.09 g/L，發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)含量下降了29%，蛋白酶活力達到1576 U/mL。這說明納豆芽孢桿菌在發(fā)酵過程中分泌了大量蛋白酶，將血粉中的大分子量蛋白質(zhì)降解成氨基酸和小分子量的肽類，從而導(dǎo)致總蛋白質(zhì)含量下降，可溶蛋白與游離氨基酸含量上升。另外，發(fā)酵過程中納豆芽孢桿菌大量生長，產(chǎn)生的菌體蛋白被水解也可提高發(fā)酵血粉的氨基酸含量，改善其氨基酸組成和產(chǎn)品風味。發(fā)酵血粉蛋白的可降解性大大提高，產(chǎn)物中含有大量的納豆芽孢桿菌活菌體（8.8×108cfu/mL），并具有較高的蛋白酶活力，可作為潛力巨大的高蛋白益生產(chǎn)品使用（表5）。

表5 血粉發(fā)酵液的成分分析

3 結(jié)論

3.1 利用Box-Behnken試驗設(shè)計建立影響發(fā)酵血粉水解度的二次多項數(shù)學模型，并利用統(tǒng)計學方法對該模型進行了顯著性檢驗，獲得最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度36.6℃、接種量6.6%、轉(zhuǎn)速202 r/min。在優(yōu)化條件下經(jīng)5批搖瓶培養(yǎng)試驗驗證，預(yù)測值與驗證試驗平均值接近，與原始培養(yǎng)條件相比，水解度提高了42.3%，達到29.1%。

3.2 血粉經(jīng)納豆芽孢桿菌發(fā)酵后，氣味有所改善，發(fā)酵液中可溶性氮和游離氨基酸含量分別增加至4.24 g/L和1.09 g/L，蛋白質(zhì)含量下降了29%，蛋白酶活力達到1576 U/mL，納豆芽孢桿菌活菌數(shù)量達到8.8×108cfu/mL，具有良好的營養(yǎng)價值和益生特性。

[1]方俊，盧向陽，蔣紅梅，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化制備豬血小肽發(fā)酵條件的研究[J].食品科學，2006，27（8）：141～144.

[2]龐偉.豬血多肽的發(fā)酵法制備及其ACE抑制活性研究：[碩士學位論文][D].合肥：合肥工業(yè)大學，2009.