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        納豆芽孢桿菌發(fā)酵制備高蛋白微生態(tài)血粉的研究

        2015-12-16 07:57:04潘春梅李彥紅袁麗娟
        中國(guó)飼料 2015年9期
        關(guān)鍵詞:納豆芽孢蛋白酶

        潘春梅, 李彥紅, 袁麗娟

        (1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院生物工程系,河南鄭州 450046;2.鄭州大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院,河南鄭州 450052;3.鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)流通中心,河南鄭州 450006)

        動(dòng)物血液中蛋白質(zhì)含量高,可作為畜禽蛋白質(zhì)飼料來(lái)源。但是由于加工成本高,設(shè)備不配套以及血粉中蛋白質(zhì)分子量大、難消化、適口性差等原因,造成血粉資源大量浪費(fèi),而且嚴(yán)重污染環(huán)境(方俊等,2006)。目前利用微生物發(fā)酵方法對(duì)血粉進(jìn)行處理,可不同程度解決血粉消化率低、氨基酸平衡性差、功能單一等問(wèn)題。如能利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段,利用益生菌將血粉進(jìn)行微生物發(fā)酵,在提高其蛋白消化利用率和適口性的同時(shí),增加益生菌的數(shù)量,制備高效的高蛋白微生態(tài)血粉,對(duì)于改善動(dòng)物的健康狀況有著重要意義。因此,本試驗(yàn)選擇具有較高蛋白酶活力和顯著益生特性的納豆芽孢桿菌作為發(fā)酵菌株,利用響應(yīng)面方法對(duì)微生態(tài)血粉的發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。

        1 材料與方法

        1.1 菌種 納豆芽孢桿菌 (Bacillus natto ZZ18)由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離保存。

        1.2 原料 血粉由河南君安生物科技有限公司提供,豆粕粉由鄭州天宇飼料科技有限公司提供,粗蛋白質(zhì)含量分別為79.3%、43.2%。

        1.3 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基:營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,裝液量為50 mL/250 mL三角瓶,121℃滅菌15 min。血粉發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蔗糖 10,玉米粉 10,血粉 100,豆粕粉10,初始pH自然,裝液量50 mL/250 mL三角瓶,115℃滅菌30 min。

        1.4 試驗(yàn)方法

        1.4.1 發(fā)酵培養(yǎng) 接一環(huán)已經(jīng)活化的納豆芽孢桿菌至種子培養(yǎng)基中,30℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。將擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)的納豆芽孢桿菌加入到滅菌后的血粉發(fā)酵培養(yǎng)基中,在一定條件下恒溫振蕩培養(yǎng)72 h。取出培養(yǎng)液,測(cè)定細(xì)菌總數(shù)、游離氨基酸含量、可溶性蛋白質(zhì)含量,并計(jì)算水解度。每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣。

        1.4.2 發(fā)酵優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn),包括12個(gè)析因試驗(yàn)和3個(gè)中心試驗(yàn)。以發(fā)酵溫度(X1)、接種量(X2)、搖床轉(zhuǎn)速(X3)為自變量,經(jīng)過(guò)下述公式分別進(jìn)行編碼轉(zhuǎn)換:X1=(X1-34)/4;X2=(X2-6)/2;X3=(X3-180)/40。響應(yīng)面優(yōu)化回歸分析模型為:

        式中:β0、βi、βii和 βij分別是截距及回歸系數(shù);xi、xj是編碼轉(zhuǎn)換后的自變量;響應(yīng)值Y為血粉的水解度。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1和表2,利用Minitab軟件對(duì)響應(yīng)值和自變量之間的關(guān)系進(jìn)行擬合統(tǒng)計(jì)分析。

        表1 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平

        表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)安排及不同發(fā)酵條件下血粉的水解度

        1.4.3 水解度的測(cè)定 取血粉發(fā)酵液10 mL,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸10 mL,混勻后靜置30 min,4℃、10000 r/min離心 15 min,半微量凱氏定氮法測(cè)定上清液中三氯乙酸(TCA)可溶氮含量。分別測(cè)定血粉發(fā)酵前總氮含量以及發(fā)酵前后可溶性氮含量,按以下公式進(jìn)行計(jì)算:

        水解度 (DH)/%=(發(fā)酵后的可溶性氮含量-發(fā)酵前的可溶性氮含量)/發(fā)醇前總氮含量×100。

        1.4.4 游離氨基酸總量的測(cè)定 采用茚三酮法測(cè)定游離氨基酸總量(龐偉,2009)。

        1.4.5 蛋白酶活性測(cè)定 蛋白酶活性采用Folin酚法測(cè)定,酶活定義為1 mL酶液在40℃、pH 7.2條件下,每分鐘水解酪蛋白釋放出1 μg酪氨酸所需的酶量為1個(gè)活力單位(龐偉,2009)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 納豆芽孢桿菌發(fā)酵血粉工藝條件的響應(yīng)面優(yōu)化 在納豆芽孢桿菌發(fā)酵血粉的過(guò)程中,發(fā)酵溫度、接種量和轉(zhuǎn)速都會(huì)影響納豆芽孢桿菌的生長(zhǎng)和血粉的水解。利用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究發(fā)酵溫度(X1)、接種量(X2)、轉(zhuǎn)速(X3)對(duì)納豆芽孢桿菌血粉發(fā)酵水解度的影響。利用統(tǒng)計(jì)軟件MINITAB14.11對(duì)血粉水解度DH(表2)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合和數(shù)據(jù)分析,建立最佳血粉發(fā)酵條件的二次響應(yīng)面回歸模型。由表3可知,擬合的三元二次方程為:

        式中:X1、X2和X3分別代表發(fā)酵溫度、接種量和搖床轉(zhuǎn)速的編碼水平;Y1代表血粉水解度預(yù)測(cè)值。

        為檢驗(yàn)方程的有效性,對(duì)血粉水解度的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知,一次項(xiàng) X1、X3極顯著(P < 0.01),X2不顯著,表明發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速對(duì)血粉的水解具有較大的影響。二次項(xiàng)中 X12、X22、X32均具有顯著差異(P < 0.1)。 交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X2X3均不顯著,說(shuō)明發(fā)酵溫度和接種量、發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速、轉(zhuǎn)速和接種量的交互作用對(duì)發(fā)酵血粉無(wú)顯著影響。

        為檢驗(yàn)方程的有效性,對(duì)水解度DH的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知,二次回歸模型的F值為15.06,相應(yīng)的概率值P<0.004,模型決定系數(shù)R2=0.964,表明該模型回歸顯著,說(shuō)明該模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果擬合程度較好,試驗(yàn)誤差小,預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間具有高度的相關(guān)性,較好地反映了血粉水解度DH與發(fā)酵溫度、接種量、轉(zhuǎn)速的關(guān)系,因此可以用此模型對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵血粉水解度進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

        表3 Box-Benhnken試驗(yàn)對(duì)血粉水解度的回歸分析結(jié)果

        表4 血粉水解度回歸方程的方差分析

        為了求得發(fā)酵血粉的最佳培養(yǎng)條件,對(duì)所得的回歸擬和方程分別對(duì)各自的變量求一階偏導(dǎo),并令其為0,得到三元一次方程組,求解此方程組得出該模型的極值點(diǎn):X1=0.6449、X2=0.1309、X3=0.5532、Y=29.2,即當(dāng)發(fā)酵溫度36.6℃、接種量6.6%和轉(zhuǎn)速為202 r/min時(shí),發(fā)酵血粉的理論最大DH值為29.2%。

        根據(jù)獲得的回歸方程,利用Minitab繪出不同發(fā)酵條件下發(fā)酵血粉水解度的響應(yīng)面分析圖及其等高線(xiàn)圖,見(jiàn)圖1至圖3。每個(gè)響應(yīng)面分別代表兩個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用,此時(shí)第三個(gè)變量保持在最佳值水平,由響應(yīng)面圖可以看出:所有的響應(yīng)面圖均呈現(xiàn)明顯的峰值,這意味著最佳的發(fā)酵條件在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的考察范圍內(nèi),其中溫度對(duì)發(fā)酵血粉水解度的影響最為顯著,當(dāng)轉(zhuǎn)速和接種量固定在最佳水平時(shí),發(fā)酵溫度在30~36.6℃,發(fā)酵血粉的水解度隨著發(fā)酵溫度的升高而顯著提高,當(dāng)溫度高于36.6℃時(shí),水解度降低。當(dāng)發(fā)酵溫度和接種量固定在最佳水平時(shí),轉(zhuǎn)速由140 r/min增至202 r/min,發(fā)酵血粉的水解度則隨之提高。這是因?yàn)樵谶m當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和溶氧水平下,納豆芽孢桿菌能產(chǎn)生較高活力的蛋白酶,將血粉蛋白中的高分子物質(zhì)水解。同時(shí),由相應(yīng)的等高線(xiàn)圖可以看出,在圖1至圖3中的等高線(xiàn)圖接近圓形,交互作用均不顯著。

        圖1 溫度和轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵血粉水解度的影響(接種量固定為6.6%)

        圖2 接種量和轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵血粉水解度的影響(溫度固定為36.6℃)

        圖3 接種量和溫度對(duì)發(fā)酵血粉水解度的影響(轉(zhuǎn)速固定為202 r/min)

        2.2 納豆芽孢桿菌發(fā)酵血粉最佳發(fā)酵條件驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)求得的最優(yōu)回歸方程和試驗(yàn)結(jié)果,得到發(fā)酵血粉水解度達(dá)最大值時(shí)的組合為:發(fā)酵溫度36.6℃、接種量6.6%和轉(zhuǎn)速為202 r/min。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),搖瓶培養(yǎng)試驗(yàn)測(cè)得的數(shù)據(jù)為29.1%±0.2%(n=5),試驗(yàn)值與理論預(yù)測(cè)值非常接近,可見(jiàn)該模型可以較好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況,從而也證明了響應(yīng)面法優(yōu)化血粉發(fā)酵條件的可行性。

        2.3 發(fā)酵血粉的組分分析 血粉與玉米粉、豆粕粉等混合物料經(jīng)納豆芽孢桿菌發(fā)酵后,發(fā)酵液外觀為淡紅色,具有發(fā)酵血液特殊醇香,無(wú)明顯血腥味和不良異味,室溫下保存6個(gè)月不變質(zhì)。經(jīng)納豆芽孢桿菌發(fā)酵后,發(fā)酵液中可溶性氮含量由發(fā)酵前的0.35 g/L增加至4.24 g/L,游離氨基酸含量由發(fā)酵前的0.17 g/L增加至1.09 g/L,發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)含量下降了29%,蛋白酶活力達(dá)到1576 U/mL。這說(shuō)明納豆芽孢桿菌在發(fā)酵過(guò)程中分泌了大量蛋白酶,將血粉中的大分子量蛋白質(zhì)降解成氨基酸和小分子量的肽類(lèi),從而導(dǎo)致總蛋白質(zhì)含量下降,可溶蛋白與游離氨基酸含量上升。另外,發(fā)酵過(guò)程中納豆芽孢桿菌大量生長(zhǎng),產(chǎn)生的菌體蛋白被水解也可提高發(fā)酵血粉的氨基酸含量,改善其氨基酸組成和產(chǎn)品風(fēng)味。發(fā)酵血粉蛋白的可降解性大大提高,產(chǎn)物中含有大量的納豆芽孢桿菌活菌體(8.8×108cfu/mL),并具有較高的蛋白酶活力,可作為潛力巨大的高蛋白益生產(chǎn)品使用(表5)。

        表5 血粉發(fā)酵液的成分分析

        3 結(jié)論

        3.1 利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立影響發(fā)酵血粉水解度的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型,并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)該模型進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn),獲得最佳發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度36.6℃、接種量6.6%、轉(zhuǎn)速202 r/min。在優(yōu)化條件下經(jīng)5批搖瓶培養(yǎng)試驗(yàn)驗(yàn)證,預(yù)測(cè)值與驗(yàn)證試驗(yàn)平均值接近,與原始培養(yǎng)條件相比,水解度提高了42.3%,達(dá)到29.1%。

        3.2 血粉經(jīng)納豆芽孢桿菌發(fā)酵后,氣味有所改善,發(fā)酵液中可溶性氮和游離氨基酸含量分別增加至4.24 g/L和1.09 g/L,蛋白質(zhì)含量下降了29%,蛋白酶活力達(dá)到1576 U/mL,納豆芽孢桿菌活菌數(shù)量達(dá)到8.8×108cfu/mL,具有良好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和益生特性。

        [1]方俊,盧向陽(yáng),蔣紅梅,等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化制備豬血小肽發(fā)酵條件的研究[J].食品科學(xué),2006,27(8):141~144.

        [2]龐偉.豬血多肽的發(fā)酵法制備及其ACE抑制活性研究:[碩士學(xué)位論文][D].合肥:合肥工業(yè)大學(xué),2009.

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