龍 淼， 何潤霞， 劉敏月， 于 丹， 邵啟冰， 童柳蔭， 李松菲， 高增貴

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧沈陽 110866；2.遼寧省農(nóng)牧機械研究所有限公司，遼寧沈陽110036；3.沈陽工學院經(jīng)濟與管理學院，遼寧撫順113112；4.沈陽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，遼寧沈陽 110866）

本試驗采用傳統(tǒng)培養(yǎng)與分子生物學技術(shù)相結(jié)合的方法對兔腸道中菌株進行了分離和鑒定，并對其產(chǎn)酶能力和安全性進行了研究，為研制適用于兔的微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器 GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國Biorad公司）；S1000型 PCR 儀（美國伯樂）；PowerPac Basic型電泳儀 （美國伯樂）；Legend Micro 17R小型冷凍離心機 （美國Thermo Scientific）；VS-1渦旋振蕩器 （北京鼎昊源科技有限公司）；CC6小型離心機 （北京鼎昊源科技有限公司）；DYCP-31DN水平電泳槽（北京六一）；SW-CJ-1F型超凈工作臺 （蘇州安泰）；THZ-98c恒溫搖床（上海一恒）；DNP-9162普通培養(yǎng)箱（上海精宏）；ldzx-50kds高壓蒸汽滅菌器 （上海申安醫(yī)療器械廠）；DHG-9075A電熱恒溫干燥箱（上海一恒）。

1.2 試驗材料 PCR Mix試劑盒、Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒，購自上海生工；PCR引物由上海生工合成；LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基；改良GAM肉湯、纖維素酶選擇培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；生化試劑、微量生化管等，均購自杭州天和微生物試劑有限公司；革蘭氏染色液，購自青島海博生物技術(shù)有限公司；TE緩沖液（自配）；溶菌酶、蛋白酶K、十二烷基磺酸鈉（SDS）、DL2000Marker電泳級瓊脂糖，購自上海生工）；家兔購自沈陽某養(yǎng)殖場。淀粉酶選擇培養(yǎng)基、蛋白酶選擇培養(yǎng)基根據(jù)任香蕓等（2007）、于萍和勵建榮（2006）、戴玄等（1997）的方法配制。

1.3 試驗方法

1.3.1 細菌分離 無菌采取家兔腸道內(nèi)容物，分段收集腸道內(nèi)容物 （十二指腸、空腸、回腸和盲腸），用無菌棉簽沾取腸道內(nèi)容物，迅速將其加入到含有20 mL滅菌水的滅菌三角瓶內(nèi)，搖動片刻，然后小火加熱至懸液沸騰，維持2 min。然后靜止5 min，吸取上層液0.1 mL，涂布于LB固體培養(yǎng)基，用封口膜將平皿封好，倒置于厭氧培養(yǎng)罐中，迅速放入?yún)捬醮⑸w好蓋，厭氧培養(yǎng)48 h，挑取單菌落，于改良GAM肉湯進行厭氧培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)特性，進行革蘭氏染色，選取疑似芽孢桿菌的菌株進行下列試驗。

1.3.2 生化鑒定 抑菌效果好的菌株用改良GAM肉湯培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移接種于生化反應(yīng)管，根據(jù)杭州天和微生物試劑有限公司 《細菌微量生化反應(yīng)管使用說明書》觀察反應(yīng)結(jié)果。主要鑒定項目：接觸酶試驗、脲酶試驗、糖醇類發(fā)酵試驗、硝酸鹽還原試驗、H2S產(chǎn)生試驗等。

1.3.3 16SrRNA序列測定及同源性分析 16Sr-RNA序列測定引物采用通用引物 27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和 1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。分離株進行基因組DNA提取，基因組DNA的提取采用生工柱式細菌基因組提取試劑盒進行提取，操作方法按照說明書進行。PCR反應(yīng)，以提取的菌株基因組為模板，進行PCR擴增16SrRNA序列，體系為30 μL體系:模板1 μL，上游引物和下游引物各1 μL，PCR Mix 15 μL，剩下由無菌水補足。反應(yīng)條件：PCR 條件：95 ℃ 5min；94 ℃ 40 s，54 ℃ 40 s，72 ℃延伸 1 min，30個循環(huán)；72℃ 5 min，4℃結(jié)束。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。測序由上海生工生物工程技術(shù)有限公司純化和測序。測序結(jié)果在NCBI使用Blast比對，從 GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得與菌株16SrDNA 源的公認標準序列數(shù)據(jù)，使用Clustal X 1.8將不同的序列對齊后，使用DNAman5.1構(gòu)建菌株的系統(tǒng)進化樹。

1.3.4 T2-shier-5菌株產(chǎn)酶活性測定 接種過夜培養(yǎng)的環(huán)芽孢桿菌T2-shier- 51 mL至100 mL的GAM培養(yǎng)基，37℃，180 r/min過夜培養(yǎng)，取10 mL活化好的菌液，8000 r/min離心5 min，棄上清，將沉淀用無菌水調(diào)節(jié)OD值至0.5左右（約5×107cfu/mL），接種到滅菌的菜籽粕、豆柏、麩皮、棉籽粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量1 mL/瓶。振蕩混合，使接種菌液與培養(yǎng)基充分接觸。將接種好的培養(yǎng)基至于37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48 h。然后，取培養(yǎng)好的固體培養(yǎng)物2.5 g，加入pH 6.7磷酸緩沖液 25 mL，200 r/min搖床中振蕩 30 min后，4000 r/min離心5 min，取上清液為粗酶液，測定其中蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶（木聚糖酶）、淀粉酶和幾丁質(zhì)酶活。纖維素酶活力、粗酶液蛋白酶活力、粗酶液淀粉酶活力和幾丁質(zhì)酶活力測定參照陸文清等（2003）、張麗萍和徐巖（2002）、劉德海等（2002）、顧真榮等（2001）、張樹政（1984）的方法。

1.3.5 安全性檢測 采用腹腔注射法進行動物試驗，刮取平板上純培養(yǎng)的菌苔，以無菌生理鹽水制成濃度為5.0×109cfu/mL的菌懸液，設(shè)置空白組合對照組，每組共10只小鼠。每只健康成年昆明小鼠一次性腹腔注射0.3 mL，連續(xù)觀察7 d。記錄觀察期間小鼠中毒表現(xiàn)及死亡情況，如與對照組相比未觀察到受試小鼠有毒性反應(yīng)及引起死亡，則判定待檢菌株無毒性。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學特征 分離菌株T2-shier-5在GAM培養(yǎng)基上生長良好，24 h形成直徑2～4 mm大小的圓形菌落，呈污白色，菌落不透明，表面水分較少且粗糙有褶皺；油鏡觀察結(jié)果為革蘭氏陽性，菌體形態(tài)為短桿狀，單個、成對或鏈狀排列，芽孢橢圓、柱狀，由于該菌株革蘭氏染色是在GAM固體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后進行的，可見大多數(shù)細菌死亡，但形態(tài)依然可見。

2.2 生理生化特征 將表1中的結(jié)果與《伯杰氏細菌鑒定手冊》中關(guān)于芽孢桿菌的描述及其他一些生化特性相對照，該分離株可初步判定為枯草芽孢桿菌。

2.3 16SrRNA序列測定及同源性分析結(jié)果 由圖1可見，T2-shier-5菌株的16S rRNA擴增片段長度為1452 bp。16SrRNA基因測序結(jié)果已呈送GenBank數(shù)據(jù)庫中并被收錄，收錄號為：KP696781。用BLAST進行序列比對，結(jié)果表明，分離菌株與GenBank中發(fā)表的 Bacillus subtilis strain GD1（登錄號HM055597.1）和 Bacillus subtilis strain CCM9 （登錄號HQ536000.1）16SrRNA同源性均達到99.9%。用DNAStar軟件對T2-shier-5菌株基因與GenBank中已公布的序列比對分析，生成系統(tǒng)發(fā)生樹。由圖2和圖3可知，T2-shier-5菌株與 Bacillus subtilis strain GD1菌株屬于同一分支，核苷酸同源性最高，達到99.9%，與另一分支的枯草芽孢桿菌WSEKSU304和WSR-KSU310的核苷酸同源性分別為98.7%和99.8%。確定分離菌株為Bacillus subtilis，命名為 Bacillus subtilis T2-shier-5。

表1 T2-shier-5生理生化鑒定結(jié)果

圖1 T2-shier-5菌株P(guān)CR電泳圖

圖2 T2-shier-5基因系統(tǒng)發(fā)生樹

2.4 產(chǎn)酶能力 由表2可知，該分離株具有較強的纖維素降解能力，但產(chǎn)幾丁質(zhì)酶能力很低。

圖3 T2-shier-5菌株與參考株序列同源性分析

表2 T2-shier-5的產(chǎn)酶活性

2.5 安全性檢測 對腹腔注射的昆明小鼠連續(xù)觀察7 d并未觀察到中毒癥狀及死亡情況。剖檢后也未見任何病理變化，未從各臟器培養(yǎng)出該菌。各對照組均正常。試驗結(jié)果表明所分離的芽孢桿菌菌株無致病性。

3 討論

本試驗中，先通過傳統(tǒng)方法對分離出來的菌株做菌落形態(tài)觀察和生理生化檢測，然后運用16SrDNA核酸序列分析進行菌株鑒定，這樣可以最大程度地保證結(jié)果的準確性和客觀性（龍淼等，2009）。試驗中分離出的T2-shier-5菌株的菌落形態(tài)和生理生化特性都與標準枯草芽孢桿菌較為一致，并且16SrDNA核酸全序列與枯草芽孢桿菌的同源性最高，達到99%以上，說明T2-shier-5與枯草芽孢桿菌的親緣關(guān)系最近，由進化樹看出，T2-shier-5與芽孢桿菌科芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌聚在同一個分支，結(jié)合細菌的菌落形態(tài)、生理生化特征可將T2-shier-5鑒定為枯草芽孢桿菌。

芽孢桿菌能產(chǎn)生多種酶類，參與動物消化道的酶池，促進動物對營養(yǎng)物的消化吸收?？莶菅勘U菌具有較強的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，同時還具有降解植物飼料中復(fù)雜碳水化合物的酶，如果膠酶、葡聚糖酶等（Singh等，2015）。本試驗分離到的T2-shier-5可產(chǎn)生多種酶，有很強的產(chǎn)纖維素酶能力，但產(chǎn)幾丁質(zhì)酶能力較低，這可能與其生存環(huán)境有關(guān)。

4 結(jié)論

本試驗從健康兔腸道內(nèi)分離到一株芽孢桿菌，經(jīng)形態(tài)觀察、革蘭氏染色和16SrRNA序列分析，確定其為枯草芽孢桿菌。通過菌株的產(chǎn)酶試驗和安全性試驗得出結(jié)論，該分離株具有一定的益生作用。

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