均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)選肝豆湯的效應(yīng)中藥配伍

——以TX小鼠神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平

及血清和腦組織中銅含量為指標(biāo)

汪世靖1,2，趙雯1,2，陳林1,2，董健健1,2，程楠2，韓永升2，胡文彬2，韓詠竹2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，安徽 合肥230038；

2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所附屬醫(yī)院，安徽 合肥230061)

[摘要]目的基于均勻設(shè)計(jì)法篩選中藥復(fù)方肝豆湯保護(hù)TX小鼠神經(jīng)細(xì)胞的效應(yīng)中藥。方法基于“6因子11水平表”均勻設(shè)計(jì)法，以神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平及血清和腦組織中銅含量為指標(biāo)，以TX小鼠為Wilson病動(dòng)物模型，采用多元逐步回歸分析法優(yōu)選肝豆湯中6種藥物(大黃、姜黃、黃連、澤瀉、金錢草、三七)的效應(yīng)中藥配伍。采用Western blot法以及等離子質(zhì)譜法分別測定細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和血清、腦組織銅含量。結(jié)果與對照組比較，TX小鼠腦組織中Bcl-2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，腦組織銅含量顯著升高(P<0.05)，血清銅含量顯著降低(P<0.05)。多元逐步回歸分析結(jié)果顯示，姜黃和大黃分別進(jìn)入血清銅含量及腦組織銅含量的回歸方程，黃連和澤瀉均進(jìn)入腦組織Bcl-2和Bax表達(dá)水平的回歸方程，姜黃和金錢草分別進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2/Bax的回歸方程，三七均未進(jìn)入上述指標(biāo)的回歸方程。結(jié)論肝豆湯中大黃、姜黃、黃連、澤瀉、金錢草配伍組合，可通過多靶點(diǎn)保護(hù)TX小鼠神經(jīng)細(xì)胞；三七在保護(hù)TX小鼠神經(jīng)細(xì)胞過程中未發(fā)揮明顯效應(yīng)。

[關(guān)鍵詞]均勻設(shè)計(jì)法；肝豆湯；效應(yīng)中藥；配伍

[中圖分類號(hào)]R742.4；R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.05.021

項(xiàng)目基金基金資助：安徽省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(12010402114)；國家自然科學(xué)(81473535)

作者簡介：汪世靖(1989-)，男，碩士研究生

收稿日期：(2015-05-07；編輯：姚實(shí)林)

肝豆?fàn)詈俗冃杂址QWilson’s病(Wilson’s disease，WD)，是一種常染色體隱性遺傳銅代謝障礙疾病[1]，其主要臨床表現(xiàn)為肝臟損傷和腦損傷癥狀，其中40%～60%的WD患者存在震顫、肌僵直、言語不清、流涎、步態(tài)異常等腦損傷臨床表現(xiàn)[2]。韓詠竹等[3]采用中西結(jié)合方法治療WD，所用肝豆湯對具有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的WD患者療效明確。均勻設(shè)計(jì)法[5]是一種將數(shù)論和多元統(tǒng)計(jì)相結(jié)合，以較少實(shí)驗(yàn)次數(shù)優(yōu)化最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)的實(shí)驗(yàn)方法，具有“均勻分散”及方便、實(shí)用、預(yù)測性好的特性，對多因素、多水平的實(shí)驗(yàn)研究較為適用。由于中藥復(fù)方具有藥味較多(多因素)、劑量不等(多水平)的特點(diǎn)，因此，從理論上看，將藥效學(xué)與均勻設(shè)計(jì)法相結(jié)合，應(yīng)用到中藥復(fù)方研究是可行的。本課題組既往曾采用均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)選了益氣化痰方抗抑郁不同作用途徑的效應(yīng)中藥配伍[4]，在此基礎(chǔ)上，本研究以中藥復(fù)方肝豆湯中6種藥物(大黃、黃連、澤瀉、姜黃、金錢草、三七)為對象，運(yùn)用均勻設(shè)計(jì)法對肝豆湯中保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的效應(yīng)中藥進(jìn)行篩選。

通信作者：韓詠竹，hyz89722@sina.com

1　材料

1.1主要試劑與器材兔抗Bcl-2、Bax多克隆一

structure of mitochondria was complete, there was not mitochondria swelling, and chromatin were evenly distributed; in the middle- and low-dose GTKPM groups, the vascular wall was integral, some VECs were swelling, the nuclear membrane was intact, the dilatation of rough endoplasmic reticulum was observed, the ribosomes slightly decreased, and mitochondria swelling and vacuolar degeneration were observed in some mitochondria. ConclusionGranules for tonifying the kidney and preventing miscarriage can repair the damaged cellular structure in decidual tissue of RSA mice, who have impaired angiogenesis at the maternal-fetal interface, and improve angiogenesis and the integrity of cell organelle to play the role of miscarriage prevention.

[Key words] granules for tonifying the kidney and preventing miscarriage; recurrent spontaneous abortion; decidual tissue; ultrastructure

抗均購于英國Abcam公司，二抗均為Abcam公司辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG；Fine Do X6全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)：上海天能科技有限公司提供，用于蛋白條帶顯色。WX-3000微波消解儀：由上海屹堯公司提供，用于腦組織及血清的消解；XSERAES Ⅱ等離子體質(zhì)譜儀及ACAT-6300等離子體光譜儀：由美國熱電公司提供，用于微量元素檢測。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物肝豆湯組成藥物(大黃、姜黃、黃連、澤瀉、金錢草、三七)：均購于北京同仁堂藥店安徽合肥分店，采用傳統(tǒng)水煎提取工藝制備成各實(shí)驗(yàn)組對應(yīng)藥物，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為WD模型TX小鼠，由10對TX小鼠種鼠(從美國Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn))飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，并進(jìn)行傳代繁殖。飼養(yǎng)環(huán)境溫度18～20 ℃，相對濕度45%～65%。模型動(dòng)物在入組前隨機(jī)選擇3只進(jìn)行銅生化指標(biāo)(銅藍(lán)蛋白、銅氧化酶、血清銅等)和基因檢測以確保種鼠及其子代的遺傳均一性。

2　方法

2.1運(yùn)用均勻設(shè)計(jì)方案[5]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組選用U11*(118)(8因子11水平)表，將肝豆湯原方中6味中藥(大黃、姜黃、黃連、澤瀉、金錢草、三七)作為考察因子，每個(gè)因子各取11個(gè)水平(每個(gè)水平為10 g小鼠每日給藥量，依據(jù)《中華人民共和國藥典》所規(guī)定的成人每日最大用藥量，再根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[6]換算得出小鼠的用藥劑量約為成人的10倍)，規(guī)定大黃、姜黃、黃連分別在0～4.00 g的劑量范圍內(nèi)遞增11次，澤瀉、金錢草分別在0～4.80 g的劑量范圍內(nèi)遞增11次，三七在0～0.60 g的劑量范圍內(nèi)遞增11次。同時(shí)根據(jù)U11*(116)均勻設(shè)計(jì)表安排各因子和水平，進(jìn)行組方設(shè)計(jì)。見表1。

表1　 按U 11*(11 6)均勻設(shè)計(jì)方案確定的實(shí)驗(yàn)組方

2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥WD模型TX雄性小鼠72只(2月齡)，3月齡6只，SPF級，體質(zhì)量(22～23.5)g；另取2月齡、3月齡野生型(the wild type, DL)小鼠各6只，作為正常對照組。模型組為2月齡、3月齡各6只；其余2月齡66只TX雄性小鼠按隨機(jī)分組原則分為11個(gè)“藥物組”(組號(hào)1～11，每組6只)。藥物按表1均勻設(shè)計(jì)方案，按其劑量配比要求配制各組灌胃液，配制濃度均以達(dá)到22 g小鼠灌胃要求為準(zhǔn)。模型組和正常對照組同時(shí)予以相同容積的飲用水，灌胃時(shí)間1個(gè)月。

2.3標(biāo)本取材各小鼠稱質(zhì)量，于腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)，麻醉成功后將小鼠摘眼球取血后固定于手術(shù)臺(tái)，打開胸腔，暴露心臟，從心尖處剪一個(gè)3 mm左右的切口，將12號(hào)乳鼠灌胃針頭經(jīng)心尖插入左心室，剪開右心耳，向心臟輸注生理鹽水，再移動(dòng)灌胃針使之插入主動(dòng)脈，確定灌胃針頭進(jìn)入主動(dòng)脈后，用血管鉗將針頭和心臟夾住固定，快速灌注4 ℃生理鹽水，當(dāng)右心耳處有澄清液體流出，肝臟變白時(shí)，完整取出腦組織，置于-80 ℃冰箱凍存。

2.4Western bolt法檢測Bcl-2、Bax表達(dá)水平將所取得的TX小鼠腦組織標(biāo)本按每20 mg組織加入200 μL裂解液(含PMSF)，待組織充分裂解后，將組織混懸液移至1.5 mL離心管中，離心后吸取上清液，保存?zhèn)溆?。將制備好的蛋白樣品采用SDS-PAGE電泳法電泳后，滴加一抗，4 ℃孵育過夜，次日取出，用PBS液沖洗后，室溫孵育二抗2 h，ECL顯色，用Quantity one灰度值分析軟件進(jìn)行分析，同時(shí)以GAPDH蛋白表達(dá)水平作為參照，以所測蛋白條帶灰度值/GAPDH灰度值作為所測蛋白相對表達(dá)水平。

2.5等離子質(zhì)譜法檢測血清和腦組織中銅含量分別取200 μL血清及0.15～0.2 g腦組織標(biāo)本，將200 μL血清同200 μL超純水放入消融試管中，加超純硝酸600 μL充分混勻，再用超純水定容至5 mL備用；另將腦組織經(jīng)雙蒸水反復(fù)沖洗表面血液后，再用濾紙吸干組織表面水分，裝入微波消解罐內(nèi)，加入8 mL超純濃硝酸，放入微波消解器中消解，最后將消解后的標(biāo)本定容至10 mL備用。采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry, ICP-AES)測定血清和腦組織標(biāo)本中銅含量。

3　結(jié)果

3.1模型因素和月齡因素對小鼠腦組織Bcl-2、Bax含量，Bcl-2/Bax和血清、腦組織Cu含量的影響兩因素方差分析結(jié)果(見表1)顯示，月齡因素僅對腦組織Bax表達(dá)水平、Bcl-2/Bax比值和腦組織Cu含量的主效應(yīng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型因素對所有指標(biāo)的主效應(yīng)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，月齡因素和模型因素對所有指標(biāo)的交互作用也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。簡單效應(yīng)分析結(jié)果(見表2)顯示，與正常組比較，TX組腦組織Bcl-2表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Bax表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2/Bax顯著升高(P<0.05)，血清Cu含量顯著升高(P<0.05)，腦組織Cu含量顯著降低(P<0.05)。各組Bcl-2和Bax蛋白的典型電泳結(jié)果見圖1。

表1　模型因素和月齡因素對小鼠腦組織Bcl-2、Bax含量，Bcl-2/Bax和血清、腦組織Cu含量影響的兩因素方差分析結(jié)果

表2　不同月齡正常組和TX組小鼠腦組織Bcl-2、Bax相對表達(dá)水平，Bcl-2/Bax和血清、腦組織Cu含量比較

注：與同組2月齡比較，*P<0.05；與同月齡正常組比較，#P<0.05。

注：1.模型組；2.對照組；3.肝豆湯組方1；4.肝豆湯組方2；5.肝豆湯組方3；6.肝豆湯組方4；7.肝豆湯組方5；8.肝豆湯組方6；9.肝豆湯組方7；10.肝豆湯組方8；11.肝豆湯組方9；12.肝豆湯組方10；13.肝豆湯組方11。

圖1各組Bcl-2、Bax蛋白的典型電泳結(jié)果(Western blot法)

3.2多元回歸分析法篩選肝豆湯對TX小鼠腦組織Bcl-2、Bax相對表達(dá)水平，Bcl-2/Bax和血清、腦組織Cu含量影響的效應(yīng)中藥肝豆湯的組方不同，各指標(biāo)的水平也不相同，描述性統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。分別對各指標(biāo)的水平和肝豆湯中各藥物的劑量進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)見表4，可見各指標(biāo)的水平與肝豆湯中各藥物劑量的相關(guān)系數(shù)明顯不一致。分別以各指標(biāo)的水平為因變量，以肝豆湯中各藥物的劑量為自變量進(jìn)行多元逐步線性回歸分析，以α=0.05作為變量進(jìn)入回歸模型的水準(zhǔn)，結(jié)果顯示，不同藥物進(jìn)入不同指標(biāo)的回歸方程，結(jié)果見表5。以Bcl-2為例，yBcl-2=1.449+30.921x黃連-19.460x澤瀉，若要Bcl-2表達(dá)水平最高，那么x黃連取最大值，x澤瀉取最小值；即效應(yīng)中藥的最佳配比為：黃連入肝豆湯組方劑量應(yīng)為4 g，澤瀉入原方劑量應(yīng)為0 g；以此類推，得出各效應(yīng)途徑的最佳藥物配比。

表3　11種肝豆湯組方對TX小鼠腦組織Bcl-2、Bax相對表達(dá)水平，

表4　TX小鼠各項(xiàng)指標(biāo)與肝豆湯中各藥物劑量的相關(guān)性

4　討論

WD的主要發(fā)病機(jī)制是ATP7B基因突變導(dǎo)致的銅代謝障礙[7-8]，患者由于體內(nèi)大量的銅元素蓄積產(chǎn)生的毒性作用而出現(xiàn)相應(yīng)的臨床表現(xiàn)。銅可從多種途徑產(chǎn)生細(xì)胞損傷，但其中最主要的理論為銅產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷[9]。Bcl-2和Bax分別為Bcl-2家族中典型的抑凋亡和促凋亡蛋白，在接受細(xì)胞內(nèi)

表5　肝豆湯中各藥物對TX小鼠腦組織中凋亡蛋白及血清和腦組織Cu含量影響的多元回歸分析結(jié)果

相關(guān)信號(hào)分子如活性氧族(reactive oxygen species，ROS)等刺激后，導(dǎo)致細(xì)胞色素C的大量釋放，后者激活Bax蛋白可形成同源二聚體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，上調(diào)Bax與Bcl-2形成異源二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡，兩者均可通過破壞線粒體膜，使得線粒體膜的通透性升高，使細(xì)胞內(nèi)蓄積的Bax、Bak等凋亡蛋白大量釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，最終激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，激活Caspase-3信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10]。高銅可以使細(xì)胞內(nèi)ROS升高，線粒體功能失調(diào)，激活c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)和Caspase-3信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡[11]。

由表1和表2分析結(jié)果可知，TX小鼠血清銅含量明顯高于正常對照組小鼠，腦組織中銅含量低于正常對照組小鼠。血清銅含量過高則會(huì)通過血腦屏障對腦組織產(chǎn)生損傷。經(jīng)多元線性回歸分析得出，大黃對腦組織中銅元素產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)作用，可促進(jìn)腦組織中過量銅的排出；姜黃可上調(diào)血清銅元素的含量，導(dǎo)致血清銅含量升高，從而導(dǎo)致銅毒性；金錢草可以下調(diào)血清銅元素的含量而產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)。由此可見肝豆湯降低不同組織中銅含量的效應(yīng)中藥不同。由表1和表2分析結(jié)果，Bax為促神經(jīng)細(xì)胞凋亡蛋白，在3月齡TX組小鼠明顯升高，提示存在神經(jīng)細(xì)胞損傷；Bcl-2為抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡蛋白，在3月齡TX組小鼠中明顯降低，提示腦保護(hù)作用下降。經(jīng)多元線性回歸分析可知，黃連可上調(diào)兩種蛋白的表達(dá)，澤瀉則可下調(diào)兩種蛋白的表達(dá)，通過比較偏回歸系數(shù)，可知黃連上調(diào)Bcl-2蛋白的效應(yīng)作用強(qiáng)于上調(diào)Bax蛋白，澤瀉下調(diào)Bax蛋白的作用效應(yīng)強(qiáng)于下調(diào)Bcl-2蛋白；Bcl-2/Bax在腦保護(hù)效應(yīng)中起重要作用，由表1和表2統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果可知，2月齡和3月齡TX小鼠腦組織中Bcl-2/Bax升高，提示存在神經(jīng)細(xì)胞損傷，經(jīng)多元線性回歸分析得出姜黃可下調(diào)Bcl-2/Bax，金錢草則可以上調(diào)Bcl-2/Bax，從而產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)。此外，在上述作用途徑與效應(yīng)中藥研究的多元逐步回歸方程中，三七均未進(jìn)入相關(guān)指標(biāo)的回歸方程，提示三七在調(diào)控Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)和調(diào)控腦組織和血清銅含量的過程中未發(fā)揮明顯效應(yīng)，但并不說明三七對神經(jīng)細(xì)胞無保護(hù)作用。由此可以推測，大黃、姜黃、黃連、澤瀉、金錢草五味中藥均具有綜合藥理作用，是肝豆湯中同時(shí)具有驅(qū)銅和調(diào)控Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的效應(yīng)中藥，但效應(yīng)中藥之間的具體劑量配比關(guān)系尚不能確定，仍有待進(jìn)一步研究。

根據(jù)本研究機(jī)構(gòu)的長期臨床實(shí)踐和觀察，WD具有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的患者多為肝腎不足型[12]。肝為將軍之官，主謀慮，膽主決斷；肝為五臟之賊，體陰用陽，五行屬木，性喜條達(dá)，故古方中治肝病之法多以柔肝緩急、疏肝解郁益肝血為主。WD患者由于先天因素導(dǎo)致多為素體陰虛，且先天稟賦不足，因而極易因先天元陽不足導(dǎo)致陰無以生，出現(xiàn)肝腎陰虛的病理特點(diǎn)。諶寧生[13]認(rèn)為本病多因?yàn)橄忍旆A賦不足，腎精匱乏，精不化血以致精血兩虛，筋脈失養(yǎng)，乃至火生風(fēng)動(dòng)，故出現(xiàn)脾氣暴躁、震顫、肌張力障礙等臨床表現(xiàn)；肝木不疏，木旺乘土，以致脾氣被遏，運(yùn)化受阻，痰濁郁毒內(nèi)生，上犯舌本，出現(xiàn)流涎、構(gòu)音不良等。王共強(qiáng)等[14]運(yùn)用中醫(yī)學(xué)絡(luò)病理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為虛、瘀、痰、毒夾雜的本虛標(biāo)實(shí)是WD患者毒損脈絡(luò)的主要病理特點(diǎn)，銅毒是毒邪致病的根本原因。但也有研究[15]認(rèn)為，WD乃是臟腑功能失調(diào)，銅濁代謝排出障礙，蓄積體內(nèi)致病的一種毒邪為患。在應(yīng)用中醫(yī)藥組方配伍時(shí)應(yīng)遵疏肝利膽排毒、清熱瀉火解毒、健脾助運(yùn)、升清降濁排毒、通腑利尿排毒、通絡(luò)活血排毒等方法。肝豆湯中，大黃、黃連清熱瀉火解毒，其中黃連又兼升清降濁排毒的功效；金錢草利膽退黃解毒；澤瀉通腑利尿排毒；姜黃、三七通絡(luò)活血排毒。諸藥相合，契合WD的復(fù)雜病機(jī)。本研究中，三七并未進(jìn)入相關(guān)指標(biāo)的回歸方程中，但作為臨床常用的活血化瘀中藥，其是否存在與其他藥配伍后發(fā)揮協(xié)同作用或存在其他藥理效應(yīng)，尚需進(jìn)一步研究。另外，由均勻設(shè)計(jì)法分析得出的“最佳配方與劑量配比”是否在特定作用途徑下發(fā)揮與復(fù)方類似的藥理效應(yīng)，也有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Trocello JM, Broussolle E, Girardot-Tinant N,et al. Wilson’s disease, 100 years later[J]. Rev Neurol (Paris)，2013,169(12):936-943.

[2]Aggarwal A, Bhatt M. Update on Wilson disease[J]. Int Rev Neurobiol，2013,110:313-348.

[3]韓詠竹, 王訓(xùn), 胡紀(jì)原, 等. 肝豆片治療32例肝豆?fàn)詈俗冃缘呐R床觀察及其對體液微量元素的影響[J]. 中醫(yī)藥研究，1998,14(4):19-22.

[4]徐銀, 周海虹, 陳少東, 等. 基于均勻設(shè)計(jì)的益氣化痰方抗抑郁不同作用途徑效應(yīng)中藥配伍研究[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2014,29(2):588-591.

[5]馬路, 劉劍剛, 史大卓. 均勻設(shè)計(jì)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005,25(3):278-281.

[6]黃繼漢, 黃曉暉, 陳志揚(yáng),等. 藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004,9(9):1069-1072.

[7]Dalvi A, Padmanaban M. Wilson’s disease: etiology, diagnosis, and treatment[J]. Dis Mon，2014,60(9):450-459.

[8]Purchase R. The link between copper and Wilson’s disease[J]. Sci Prog，2013,96(3):213-223.

[9]Gaetke LM, Chow CK. Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients[J]. Toxicology，2003,189(1-2):147-163.

[10]Czabotar PE, Lessene G, Strasser A,et al. Control of apoptosis by the BCL-2 protein family: implications for physiology and therapy[J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2014,15(1):49-63.

[11]Chen SH, Lin JK, Liu SH, et al. Apoptosis of cultured astrocytes induced by the copper and neocuproine complex through oxidative stress and JNK activation[J]. Toxicol Sci，2008,102(1):138-149.

[12]葉群榮, 胡紀(jì)源, 王共強(qiáng),等. Wilson病臨床癥狀特征和中醫(yī)證型分析[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013,32(4)：34-37.

[13]諶寧生.肝豆?fàn)詈俗冃缘闹嗅t(yī)藥治療[J]. 江西中醫(yī)藥，1997,28(3):21-22.

[14]王共強(qiáng), 葉群榮, 馬心鋒. 從絡(luò)病理論探討肝豆?fàn)詈俗冃缘陌l(fā)病機(jī)制[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2011,21(4):218-220.

[15]王殿華, 陳金亮. 中醫(yī)論治肝豆?fàn)詈俗冃缘乃悸放c方法[J].中醫(yī)雜志，2010,51(2):171-173.

A Study of Compatibility of Effective Traditional Chinese Medicine Components in Gandou Decoction Based on Uniform Design—Indicated by Protein Expression of Bcl-2 and Bax in Nerve Cells and Content of Copper in Serum and Brain Tissue of TX Mice

WANGShi-Jing1,2,ZHAOWen1,2,CHENLin1,2,DONGJian-jian1,2,CHENGNan2,HANYong-sheng2,HUWen-bin2,HANYong-zhu2

(1.GraduateDivisionofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China; 2.AffiliatedHospitalofNeurologyInstitute,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230061,China)

Abstract[] ObjectiveTo screen the effective traditional Chinese medicine (TCM) components in compound Gandou Decoction that are responsible for protection of nerve cells in TX mice based on uniform design. MethodsA uniform design table with six factors and eleven levels was used in this study. The TX mice were used as the animal model of Wilson’s disease, and the indices consisted of the protein expression of Bcl-2 and Bax in nerve cells and the content of copper in serum and brain tissue. Multiple stepwise regression analysis was performed to figure out the compatibility of the six effective TCM components in Gandou Decoction, Rheum officinale, Rhizoma Curcumae Longae, Coptis chinensis, Alisma orientalis, Lysimachia christinae, and Radix Notoginseng. Western blot and plasma mass spectrometry were used to determine the apoptosis-related proteins, Bcl-2 and Bax, and the content of copper in serum and tissue, respectively. ResultsCompared with the control group, the TX mice had significantly lower expression of Bcl-2 in brain tissue (P<0.05) and serum content of copper (P<0.05), as well as significantly higher expression of Bax (P<0.05) and content of copper in brain tissue (P<0.05). The multiple stepwise regression analysis showed that Rhizoma Curcumae Longae and Rheum officinale were influencing factors for the content of copper in serum and brain tissue, respectively; Coptis chinensis and Alisma orientalis were both influencing factors for the expression of Bax and Bcl-2 in brain tissue; Rhizoma Curcumae Longae and Lysimachia christinae were influencing factors for the Bax/Bcl-2 ratio in nerve cells; there was no relationship of Radix Notoginseng with the above indices. ConclusionRheum officinale, Rhizoma Curcumae Longae, Coptis chinensis, Alisma orientalis, and Lysimachia christinae in Gandou Decoction synergize to protect nerve cells in the TX mice by targeting multiple pathways; Radix Notoginseng has no substantial contribution to protection of nerve cells in TX mice.

[Key words]uniform design; Gandou Decoction; effective traditional Chinese medicine component; compatibility