陳秋霞　李江　楊軼

【摘 要】 目的：建立黑骨藤配伍金鐵鎖的總皂苷含量測(cè)定方法。方法：以齊墩果酸為對(duì)照，用5%的香草醛-冰醋酸及高氯酸進(jìn)行顯色，在550nm波長下運(yùn)用紫外-分光光度法對(duì)總皂苷含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：齊墩果酸在0.002～0.012mg/mL濃度范圍與吸光度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程A=62.4C-0.0101，r=0.9991，回收率為96.19%，RSD為1.43%。結(jié)論：建立了黑骨藤配伍金鐵鎖回流提取法中總皂苷含量測(cè)定方法，該方法快速、簡便，精密度和穩(wěn)定性良好，可用于黑骨藤配伍金鐵鎖復(fù)方制劑的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 黑骨藤；金鐵鎖； 配伍；總皂苷； 紫外-可見分光光度法

【中圖分類號(hào)】R29 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2017）03-0030-03

黑骨藤與金鐵鎖均為貴州十大苗藥，兩藥均可用于風(fēng)濕疼痛[1]。黑骨藤為蘿摩科杠柳屬植物黑龍骨Periploca forrestii Schltr的干燥根或全株，有通經(jīng)、活血、解毒，祛風(fēng)的功效，用于風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎痛、跌打損傷等[2]；金鐵鎖為石竹科金鐵鎖屬植物金鐵Psammosilene tunicoides W.[KG-*3/5]C.[KG-*3/5]Wu et C.[KG-*3/5]Y.[KG-*3/5]Wu的干燥根，具有祛風(fēng)除濕，散瘀止痛，解毒消腫，用于風(fēng)濕痹痛，胃脘冷痛，跌打損傷，外傷出血等[3]。本實(shí)驗(yàn)研究的復(fù)方是國家名老中醫(yī)邱德文教授用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床經(jīng)驗(yàn)方，兩藥配伍療效確切。本方是由黑骨藤與金鐵鎖組成，處方用量比例黑骨藤∶[KG-*3/5]金鐵鎖為6∶[KG-*3/5]1，金鐵鎖為國家2級(jí)保護(hù)稀有植物。本課題組在前期對(duì)于兩藥配伍的不同極性提取物的鎮(zhèn)痛、抗炎作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在相同劑量下，70%乙醇提取物的鎮(zhèn)痛抗炎作用顯著優(yōu)于水提取物的鎮(zhèn)痛抗炎作用[4]，且進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)兩藥配伍后的總皂苷具有抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用（待發(fā)表），故對(duì)兩藥配伍的70%乙醇提取物中總皂苷的含量進(jìn)行研究，以期為建立兩者組成的復(fù)方的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 紫外分光光度計(jì)GBC Cintra 20（澳大利亞照生公司）；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；BT 125D 型分析天平（Sartorius，德國賽多利斯）；恒溫水浴鍋（江蘇國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.2 材料 黑骨藤采于貴州烏當(dāng)區(qū)，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院劉芃教授鑒定為蘿摩科杠柳屬植物西南杠柳Periploca forrestii Schltr的根；金鐵鎖采于貴州威寧縣，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院劉芃教授鑒定為石竹科金鐵鎖屬植物金鐵鎖Psammosilene tunicoides W.C.Wu et c.Y.Wu的根；齊墩果酸（批號(hào)：110709-200304，中國藥品生物制品檢定所提供）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 精密稱定配伍藥材（黑骨藤∶[KG-*3/5]金鐵鎖=6∶[KG-*3/5]1）粉末（過60目篩）2.0g，加50倍量的70%乙醇，80℃水浴中冷凝回流提取3次，每次2h，濾過，合并濾液。將濾液減壓濃縮至干，用25mL水分散（混懸液），依次用石油醚、正丁醇分別萃取3次，每次25mL，棄去石油醚萃取液，合并正丁醇萃取液，減壓回收溶劑，用甲醇定容至10mL容量瓶中，作為供試品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸（不溶于水，在甲醇中溶解性好）對(duì)照品適量，加甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為0.2mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3 含量測(cè)定方法及測(cè)定波長的選擇[5] 精密吸取0.2mL對(duì)照品溶液和供試品溶液于10mL具塞試管中，水浴揮干甲醇，分別加入5% 香草醛-冰醋酸溶液（鮮配鮮用）0.2mL和高氯酸溶液0.8mL，于60℃水浴中顯色15min，取出后立即用冰水冷卻5min，再加冰醋酸至10mL，搖勻，靜置10min，以甲醇同法制備空白參比。在200～700nm 范圍進(jìn)行掃描，兩者均在550nm處有最大吸收。見圖1、2。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 分別精密吸取對(duì)照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL于10mL具塞試管中，按“2.3 ”項(xiàng)下自“水浴揮干甲醇”起依法操作，在550nm處測(cè)定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。見圖3。

結(jié)果表明，齊墩果酸在0.002～0.012mg/mL濃度范圍與吸光度成呈良好的線性關(guān)系，回歸方程：A =62.4C-0.0101，r=0.9991。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取0.2mL供試品溶液，按“2.3” 項(xiàng)下自“水浴揮干甲醇”起依法操作，在90min內(nèi)每隔10min時(shí)，在 550nm處測(cè)定一次吸光度。供試品溶液吸光度RSD為1.12%，表明供試品溶液顯色后，在90min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取0.2mL對(duì)照品溶液，共6份，按“2.3” 項(xiàng)下自“水浴揮干甲醇”起依法操作，在90min內(nèi)，550nm處測(cè)定吸光度。結(jié)果表明，對(duì)照品吸光度RSD為1.11%，表明該方法的精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次配伍藥材各6份，按“2.1”項(xiàng)下方法操作制備供試品溶液，按“2.3” 項(xiàng)下自“水浴揮干甲醇”起依法操作，在550nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果總皂苷含量RSD為1.27%。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取“2.7”項(xiàng)下已知含量的同一批次配伍藥材1.0g，共6份，分別加入等量齊墩果酸對(duì)照品適量，按“2.1”項(xiàng)下和“2.3” 項(xiàng)下方法操作，在550nm處測(cè)定吸光度，并計(jì)算回收率。

2.9 供試品提取條件的正交試驗(yàn) 根據(jù)可能影響總皂苷醇提取的因素，以乙醇用量（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）作為考察因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，提取液減壓濃縮至干，用25mL水分散（混懸液），依次用石油醚、正丁醇分別萃取3次，每次25mL，棄去石油醚萃取液，合并正丁醇萃取液，減壓回收溶劑，用甲醇定容至10mL容量瓶中，作為正交試驗(yàn)樣品，以總皂苷含量為主要考察指標(biāo)。采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，對(duì)配伍藥材提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。因素水平表、試驗(yàn)安排表、方差分析表見2～4。

方差分析表明，各因素對(duì)處方中總皂苷的含量提取均無顯著性影響。極差分析，表明四個(gè)因素對(duì)處方中總皂苷含量的提取影響因素大小順序?yàn)锳>B>D>C，優(yōu)選工藝為A2B3C3D3，，即藥材用50倍量70%乙醇，80℃回流提取3次，每次2h。

2.10 樣品含量的測(cè)定 精密稱定藥材粉末2.0g，按正交試驗(yàn)結(jié)果制備供試品溶液，按“2.3 ”項(xiàng)下自“水浴揮干甲醇”起依法操作，在550nm處測(cè)定吸光度，以齊墩果酸計(jì)，計(jì)算樣品中總皂苷的含量。見表5。

3 討論

實(shí)驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)供試品回流提取條件進(jìn)行考察，采用紫外-可見分光光度計(jì)法，以齊墩果酸為對(duì)照品，香草醛-高氯酸法顯色，對(duì)配伍中藥材中的總皂苷的含量測(cè)定進(jìn)行了方法學(xué)考察。本法操作簡單、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，可為黑骨藤配伍金鐵鎖復(fù)方的質(zhì)量控制研究提供了有效手段。為減少誤差， 稱樣、 加入顯色劑等操作均應(yīng)由專人操作，所用的香草醛-冰醋酸溶液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，否則空白值的顏色會(huì)加深，影響測(cè)定的結(jié)果。

文獻(xiàn)報(bào)道采用熊果酸、齊墩果酸分別用于黑骨藤、金鐵鎖的含量測(cè)定[6-7]。熊果酸與齊墩果酸果酸均屬于五環(huán)三萜類成分，分別為烏蘇烷型、齊墩果烷型，兩種類型在分子結(jié)構(gòu)上甲基位置不同，但其母核均為五環(huán)型[8]。在測(cè)定波長的選擇過程中，分別對(duì)熊果酸、齊墩果酸進(jìn)行波長掃描（200～700nm），結(jié)果均在550nm處由最大吸收，結(jié)合實(shí)驗(yàn)成本，選用齊墩果酸作為對(duì)照品。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2016-11-22 編輯：穆麗華）