溫旭智 楊覓 胡靜 任偉 劉寶瑞 錢曉萍

南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院腫瘤中心，江蘇南京210008

載體紅細胞腫瘤治療應用研究進展△

溫旭智 楊覓 胡靜 任偉 劉寶瑞 錢曉萍#

南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院腫瘤中心，江蘇南京210008

目前隨著人們對疾病治療的深入研究，藥物載體漸漸成為一個研究熱點，特別是在抗腫瘤藥物載體方面，載體紅細胞就是其中一種。國內外因其循環(huán)時間長、生物相容性、生物可降解性等優(yōu)勢對其進行深入的研究。本文就目前國內外載體紅細胞抗腫瘤研究及應用進展方面做簡要綜述。

紅細胞；藥物載體；抗腫瘤

目前惡性腫瘤的發(fā)病率逐年增長，發(fā)病年齡也呈現年輕化趨勢，因此對腫瘤學方面的研究也更加被人們所重視。然而人們對惡性腫瘤的研究已不僅局限在治療方面，更體現在腫瘤藥物的使用。腫瘤藥物的作用往往在抑制腫瘤細胞的同時，對機體增殖旺盛的細胞，如骨髓細胞也有一定的影響。因此使用高效、低毒藥物載體運送藥物，是降低藥物不良反應、減少藥物劑量、提高藥物療效的最佳方法。

近二十年來，關于藥物載體的研究顯示，載體紅細胞因具有良好生物相容性、生物可降解性、體內循環(huán)時間長而備受關注。另外，紅細胞作為載體有以下優(yōu)勢：資源豐富、易獲得；具有較大的表面積和體積，為藥物包載提供了大量的空間，提高載藥率；外觀為雙凹形，具有極大的變形能力，可使其順利通過直徑僅3～4μm的毛細血管[1-3]。因此，人們將紅細胞作為載體進行了更深入的研究，發(fā)現通過從生物體血液樣本中將紅細胞分離出來，采用不同技術將藥物等包埋入紅細胞即可形成載體紅細胞，并可將載體紅細胞回輸到人、生物體內。在眾多研究中也不乏對抗腫瘤藥物包埋及應用的研究。現將載體紅細胞抗腫瘤研究及應用總結如下。

1 載體紅細胞的制備

按照載體紅細胞制備原理，目前載抗腫瘤藥物紅細胞載藥體系的制備可分為兩類，包括：細胞內包埋型、細胞膜連接型，具體總結如下[4-7]。

1.1 細胞內包埋型

此類細胞內包埋型是指通過改變一定的外界條件或紅細胞的某種性質使被包載的藥物進入紅細胞內，從而形成載體紅細胞。具體方法包括，以滲透壓改變?yōu)榛A的制備方法有：低滲稀釋法、低滲溶血法、低滲預膨脹法、低滲透析法。此類方法原理為：當紅細胞處于輕度低滲（約為150 Osmmol/kg H2O）的環(huán)境中，外界水分可進入紅細胞使之發(fā)生可逆性膨脹至原體積的125%，使紅細胞變?yōu)闄E圓形，達到溶血臨界點時，紅細胞膜上一些直徑為20～50 nm的孔隙將短暫開放，藥物可經這些孔隙進入紅細胞腔，而當周圍環(huán)境恢復等滲狀態(tài)時，紅細胞又可恢復原來狀態(tài)，細胞膜上的孔隙也將恢復，藥物即包載于紅細胞內。低滲稀釋法、低滲溶血法的包載率、利用率低，同時對紅細胞損傷較大；而低滲預膨脹法、低滲透析法是目前常用的兩種包載方法，其包埋效果好、細胞恢復好。其中低滲透析法可通過專門的設備大規(guī)模地制備載體紅細胞，適合在基層血站或醫(yī)院輸血科推廣使用；而低滲預膨脹法操作更加簡單，同時也是此類方法中包載率最高的。另外此類方法中還包括：二甲亞砜誘導的滲透壓脈沖法、介電張力法、化學干擾法、以及脂質體、囊泡、細胞融合法等，其中細胞穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPP）介導的細胞內陷法[8]，這是目前載體紅細胞抗腫瘤研究中比較新穎的載藥方法，具體是利用細胞穿膜肽攜帶大分子物質直接穿透細胞膜進入細胞。這種方法避免了對細胞膜化學或物理性質的損傷及紅細胞內重要物質的丟失。目前在紅細胞載體方面運用成功的有，通過CPP介導攜帶門冬酰胺酶進入紅細胞內的載藥方法，主要應用于治療急性淋巴細胞白血病。

1.2 細胞膜連接型

此類表面連接方式可以減少對載體紅細胞的損傷及對生物相容性的影響，特異性較高。主要包括：紅細胞生成素受體（EPOR）介導連接[9]、紅細胞表面補體受體Ⅰ型（E-CR1）介導連接[10]、經化學鍵連接等。其中，藥物作為配體與載體紅細胞表面修飾的抗體結合，Mukthavaram等[11]指出，以抗CD20抗體修飾載體紅細胞，并將利妥昔單抗與抗CD20抗體結合形成利妥昔單抗載體紅細胞，動物實驗證明利妥昔單抗載體紅細胞相對于利妥昔單抗脂質體對表達CD19+/CD20+/CD45+的人淋巴瘤細胞具有較高抑制率，甚至高于90%。

2 載體紅細胞的修飾

很多抗腫瘤藥物載體不能發(fā)揮很好的優(yōu)勢，主要原因是缺乏靶向性、無法控釋藥物等。據相關研究報道，對載體紅細胞進行修飾能夠獲得良好的生物靶向性，并且通過不同的修飾方法可選擇性地作用于不同器官，同時可以提高載體紅細胞的穩(wěn)定性及控制藥物的釋放。修飾方法主要包括：戊二醛、帶3蛋白（Band3）交聯試劑、變性處理、磁化[12]等，其中在抗腫瘤研究方面，戊二醛及帶3蛋白（Band3）交聯試劑值得進一步探討，具體分析如下。

2.1 戊二醛

戊二醛為常用的細胞交聯和固定劑，其能夠與細胞膜上的蛋白交聯，增加細胞膜的穩(wěn)定性，從而避免紅細胞溶血，也可減緩藥物從細胞內流失，同時具有一定靶向性[13]。動物實驗證實，高濃度戊二醛處理過的載體紅細胞靶向定位于肝臟，而低濃度戊二醛處理過的載藥紅細胞則靶向定位于脾臟。吳江等[14]實驗證明經0.25%戊二醛溶液處理的載長春新堿紅細胞藥物釋放明顯減慢，相對于未處理的紅細胞，長春新堿的釋放速度下降了70%以上。但經此法處理的載體紅細胞滲透脆性增加，細胞變形能力降低，不易通過細小毛細血管，限制了其應用。

2.2 帶3蛋白（Band3）交聯試劑

帶3蛋白包括有BS3[bis（sulfosuccinimidyl）suberate，雙琥珀酰亞胺辛二酸酯鈉鹽]、ZnCl2、DTSP [3，3′-二流代雙（磺酸琥珀酰亞氨基丙酸酯）]。在衰老或變性紅細胞膜上帶3蛋白交聯成簇，提高自身免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）的連接能力，更易被巨噬細胞吞噬。因此，帶3蛋白交聯試劑處理的載體紅細胞具有巨噬細胞靶向性。Lotero等[15]用BS3處理分別攜帶依托泊苷的載體紅細胞，體外實驗提示巨噬細胞吞噬率從3%提高到11%，并且經帶3蛋白與巨噬細胞形成牢固連接，體內實驗提示處理后的紅細胞具有肝靶向性。

3 載體紅細胞藥物包載

隨著載體紅細胞在藥物包載方面的研究逐漸深入，載體紅細胞成功包載的藥物種類也隨之增多，包括細胞抑制劑、抗生素、激素、維生素、疫苗、酶類、嗎啡、苯丙氨酸解氨酶等[16-19]，其中載門冬酰胺酶紅細胞已應用于臨床治療急性淋巴細胞白血病[20]，載體紅細胞包載的抗腫瘤藥物也有很多，以下是近幾年研究較多的載體紅細胞包載的抗腫瘤藥物。

3.1 長春新堿

施瑩等、吳江等[21-22]對載體紅細胞包載長春新堿做了一系列臨床前的研究。運用改良的低滲預膨脹法成功將長春新堿包載入載體紅細胞中，并對載長春新堿紅細胞特性進行了一系列的體內外實驗研究。實驗證明紅細胞總載藥率為（61.42± 3.69）%，載體紅細胞回收率為（90.61±4.95）%。載體紅細胞滲透脆性減低，形態(tài)無明顯變化，體積略有增大與載藥量成正比，藥物釋放緩慢，4 h連續(xù)釋放率為（11.35±1.65）%，可穩(wěn)定貯存5 d。對于載長春新堿紅細胞體內特性的研究，在小鼠體內實驗中設置了長春新堿組、長春新堿載藥紅細胞組、未載藥紅細胞組和陰性對照組，實驗結果證實，長春新堿載藥紅細胞組在血漿中濃度穩(wěn)定而持久，72 h后仍可測出，藥物半衰期達4.1 h，是長春新堿組的2.68倍。載藥紅細胞在肝臟及腫瘤中的濃度和穩(wěn)定性均高于游離藥物，且隨著時間延長，這種優(yōu)勢也愈加顯著。載長春新堿紅細胞組對小鼠移植瘤抑瘤率達42.42%，是長春新堿組的2.43倍，并且小鼠體質量增長明顯大于長春新堿組。綜上說明紅細胞可用來包載長春新堿，包載率高，生物學特性無明顯改變；增強了抗腫瘤效果，延緩藥物釋放，延長藥物作用時間；增強了藥物向肝臟及腫瘤的靶向聚集，減少了不良反應。

3.2 甲氨蝶呤

袁盛華等[23]對紅細胞包載甲氨蝶呤做了臨床前研究。利用高滲法包載甲氨蝶呤，包封率最高達41.58%。在成功包載后進行一系列體內實驗，提示載甲氨蝶呤紅細胞相對于裸藥甲氨蝶呤血藥濃度高峰從（13.6±3.7）mg/L下降至（2.7±1.2）mg/L，半衰期從（3.9±0.8）h延長至（13.5±2.0）h，說明載甲氨蝶呤紅細胞具有緩釋作用。而在其不良反應研究中對肝癌模型小鼠肝腎功能進行評價，發(fā)現于小鼠靜脈給予載甲氨蝶呤紅細胞后，其丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、血清尿素氮（BUN）及肌酐（Scr）水平均較裸藥甲氨蝶呤下降，且接近正常水平，說明載甲氨蝶呤紅細胞對肝腎具有保護作用，相對于包載前大大提高了安全性。

3.3 紫杉醇

Harisa等[24]針對紅細胞包載紫杉醇進行了研究。該實驗通過低滲預膨脹法將紫杉醇包載入紅細胞中，包載率達到46.36%，且載紫杉醇紅細胞形態(tài)、穩(wěn)定性、滲透脆性均較包載前無明顯變化，載藥紅細胞48 h藥物釋放率為81%。

3.4 5-雜氮-2′-脫氧胞苷（5-Aza-2-dC）

Cinti等[25]運用紅細胞成功包載了5-Aza-2-dC，基于紅細胞載體的高效和靶向基礎上用病毒刺突融合糖蛋白修飾，并通過熒光染色觀察其作用于人子宮頸癌細胞的抗腫瘤作用。實驗發(fā)現12 h后載藥紅細胞膜開始與Hela細胞膜黏附，藥物釋放入腫瘤細胞內，96 h后大部分Hela細胞開始凋亡。該實驗還證實了用HA病毒蛋白修飾的載體紅細胞能通過與Hela細胞的高效黏附增強藥物的生物利用度。

其他被紅細胞包載的抗腫瘤藥物還有：依托泊苷、阿霉素、道諾霉素、柔紅霉素、多柔比星等。

4 小結

自載體紅細胞研究至今，其良好的生物相容性、生物可降解性、長循環(huán)時間等優(yōu)勢早已被人熟知，并且隨著對這些優(yōu)勢和抗腫瘤藥物研究的不斷深入，目前已包載了50多種物質用于臨床研究和應用。在載體紅細胞抗腫瘤研究中，人們通過對其進行修飾，比如戊二醛修飾、磁化、變性處理等，提高載體紅細胞在抗腫瘤方面的器官靶向性，同時增加載體紅細胞的緩釋作用，這些處理方法均提高了藥物的抗腫瘤作用。雖然載體紅細胞的研究有很多重大突破，但是目前除了載L-門冬酰胺酶紅細胞已應用于臨床治療急性淋巴細胞白血病外，大部分載體紅細胞包載藥物的研究均因藥物控釋不佳等停留在臨床前階段，并沒有真正地應用于臨床，這也是此研究留下的一點遺憾。因此對載體紅細胞載藥的研究應著重向臨床應用推廣，這才是醫(yī)學研究者以后為之努力的方向。

［1］Muzykantov VR.Drug delivery by red blood cells:vascular carriers designed by mother nature[J].Expert Opin Drug Deliv,2010,7(4):403-427.

［2］Yann G,Francoise H,Robertf F,et al.International seminar on the red blood cells as vehicles for drugs[J].Expert Opin Biol Ther,2012,12(1):127-133.

［3］Zarrin A,Foroozesh M,Hamidi M.Carrier erythrocytes: recent advances,present status,current trends and future horizons[J].Expert Opin Drug Deliv,2014,11(3):433-447.

［4］席蕓,劉寶瑞,錢曉萍.載體紅細胞在抗腫瘤治療中應用的進展[J].東南大學學報 (醫(yī)學版),2014,33 (5):626-629.

［5］Szum ilo M.Erythrocytes-the new application in medicine [J].Pol Merkur Lekarski,2013,34(199):5-8.

［6］唐華非,李霞,貢聯兵.紅細胞載藥體系研究現狀[J].中國醫(yī)院用藥評價與分析,2011,11(10):959-960.

［7］Bhateria M,Rachumallu R,Singh R,et al.Erythrocytesbased synthetic delivery systems:transition from conventional to novel engineering strategies[J].Expert Opin Drug Deliv,2014,11(8):1219-1236.

［8］He H,Ye J,Wang Y,et al.Cell-penetrating peptides meditated encapsulation of protein therapeutics into intact red blood cells and its application[J].JControl Release,2014,28(176):123-132.

［9］Patel PD,Dand N,Hirlekar RS,et al.Drug loaded erythrocytes:as novel drug delivery system[J].Curr Pharm Des,2008,14(1):63.

［10］Lindorfer MA,Hahn CS,Foley PL,et al.Hetero polymermediated clearance of immune complexesvia erythrocyte CR1:mechanisms and application[J].Immunol Rev,2001,183(1):10.

［11］Mukthavaram R,Shi G,Kesari S,et al.Targeting and depletion of circulating leukocytes and cancer cells by lipophilic antibody-modified erythrocytes[J].J Control Release,2014,10(183):146-153.

［12］范聞,嚴威,徐祖順.新型紅細胞-納米粒子載體系統(tǒng)的研究進展[J].膠體與聚合物,2011,29(4):187-189.

［13］Marczak A,Bukowska B.ROS production and their influence on the cellular antioxidative system in human erythrocytes incubated w ith daunorubicin and glutaraldehyde[J].Environ Toxicol Pharmacol,2013,36(1): 171-181.

［14］吳江,錢寶華,王卓,等.戊二醛對長春新堿載體紅細胞生物學特性的影響[J].解放軍醫(yī)學雜志, 2007,32(11):1187-1189.

［15］Lotero LA,Olmos G,Diez JC.Delivery to macrophages and toxic action of etoposide carried in mouse red blood cells[J].Biochim Biophys Acta,2003,1620 (123):160-166.

［16］Godfrin Y,Horand F,Franco R,et al.International seminar on the red blood cells as vehicles for drugs[J].Expert Opin Biol Ther,2012,12(1):127-133.

［17］Szumi?o M.Erythrocytes-the new application in medicine[J].Pol Merkur Lekarski,2013,34(199):5-8.

［18］Harisa Gel-D,Ibrahim MF,A lanazi FK.Characterization of human erythrocytes as potential carrier for pravastatin:an in vitro study[J].Int JMed Sci,2011,8 (3):222-230.

［19］Rossi L,PierigèF,Carducci C,et al.Erythrocyte-mediated delivery of phenylalanine ammonia lyase for the treatment of phenylketonuria in BTBR-Pahenu2 m ice [J].JControl Release,2014,23(194C):37-44.

［20］Gutiérrez M illán C,Colino Gandarillas CI,Sayalero Marinero ML,et al.Cell-based drug-delivery platforms [J].Ther Deliv,2012,3(1):25-41.

［21］吳江,錢寶華,王卓,等.長春新堿載藥紅細胞制備及其生物學特性研究[J].第二軍醫(yī)大學學報, 2005,26(5):551-554.

［22］施瑩,錢寶華,郭峰,等.長春新堿載體紅細胞對小鼠S180腫瘤生長的抑制作用[J].第二軍醫(yī)大學學報,2007,28(3):339-340.

［23］袁盛華,汪浩,葛衛(wèi)紅,等.甲氨蝶呤載體紅細胞對肝癌模型大鼠肝腎功能的保護作用[J].藥學與臨床研究,2010,18(2):164-167.

［24］Harisa GI,Ibrahim MF,Alanazi F,et al.Engineering erythrocytes as a novel carrier for the targeted delivery of the anticancer drug paclitaxel[J].Saudi Pharmaceutical Journal,2014,22(3):223-230.

［25］Cinti C,Taranta M,Naldi I,et al.New ly engineered magnetic erythrocytes for sustained and targeted delivery of anti-cancer therapeutic compounds[J].PLoSOne, 2011,6(2):e17132-e17132.

R730.5

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2015.13.06.06

江蘇省六大人才高峰項目（2011-WS-005）；2011年度南京市醫(yī)學科技發(fā)展計劃項目（QYK 11167）#

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（2015-02-15）