康玲，徐雋，張杰，馬艷

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院牙周黏膜科，新疆 烏魯木齊 830011）

·論著·

二氫卟吩e6光動力對人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞周期和凋亡的影響*

康玲1，徐雋2，張杰1，馬艷1

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院牙周黏膜科，新疆 烏魯木齊 830011）

目的研究二氫卟吩e6光動力療法（Ce6-PDT）對人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞周期和凋亡的影響，為闡明Ce6-PDT殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞的機(jī)制提供資料。方法激光共聚焦顯微鏡觀察Ce6在SW620細(xì)胞中的亞定位。不同濃度Ce6-PDT（0、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0及8.0μg/ml）處理SW620細(xì)胞后，熒光顯微鏡觀察活性氧的產(chǎn)生，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡，Western blot檢測細(xì)胞Caspase-3、Bcl-2、Beclin 1及LC3B蛋白表達(dá)。結(jié)果Ce6主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，其次位于線粒體中，細(xì)胞核和溶酶體中幾乎無分布。Ce6-PDT可誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生。隨著Ce6濃度的增加，Ce6-PDT能引起細(xì)胞G0/G1期阻滯、S期細(xì)胞比例減少和細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05）。Western blot結(jié)果顯示，不同濃度Ce6-PDT處理細(xì)胞后，Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。LC3B蛋白表達(dá)隨著Ce6濃度的增加先下調(diào)后上調(diào)（P＜0.05）。結(jié)論Ce6-PDT通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡抑制SW620細(xì)胞增殖、引起細(xì)胞死亡，Caspase-3、Bcl-2及LC3B可能參與了其光動力殺傷細(xì)胞的過程。

結(jié)直腸腫瘤；二氫卟吩e6；光動力療法；凋亡；自噬

結(jié)直腸癌是全球常見的惡性腫瘤之一，據(jù)流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，無論從新發(fā)病例還是估計死亡病例而言，結(jié)直腸癌在歐美仍舊是第2或第3位常見惡性腫瘤[1-2]。我國結(jié)直腸癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，預(yù)計我國結(jié)直腸癌新發(fā)病例仍將逐年增多[3]。傳統(tǒng)放化療治療對晚期轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的療效并不理想，而且也會給患者帶來許多難以耐受的副作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)二氫卟吩e6光動力治療（Chlorin e6 photodynamic therapy，Ce6-PDT）在體外能夠殺傷轉(zhuǎn)移潛能結(jié)腸癌細(xì)胞SW620、抑制細(xì)胞增殖，但其抑制細(xì)胞增殖、殺傷細(xì)胞引起細(xì)胞死亡的機(jī)制仍不清楚[4]。PDT可以通過直接殺死細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞死亡（如誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、自噬或壞死引起細(xì)胞死亡），也可通過破壞腫瘤血管或激活抗腫瘤免疫反應(yīng)引起腫瘤細(xì)胞死亡[5]。本實驗旨在前期研究基礎(chǔ)之上探討Ce6-PDT直接殺傷SW620細(xì)胞的可能機(jī)制，為Ce6-PDT應(yīng)用于結(jié)腸癌治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

二氫卟吩e6（美國Frontier Scientifici公司），Leibovitz’s L-15培養(yǎng)基及胎牛血清（美國Gibco公司）。碘化丙啶PI及RNase（美國Sigma公司），細(xì)胞器熒光探針ER-TrackerTMGreen、LysoTracker Deep Red及MitoTracker Green FM（美國Life Technologies公司），RIPA細(xì)胞裂解液（美國Thermo Scientific公司），兔抗人Beclin 1及LC3B多克隆抗體（英國Abcam公司），兔抗人Bcl-2及Caspase-3多克隆抗體（美國Cell Signaling公司），兔抗人β-Actin多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），凋亡檢測試劑盒（瑞士Roche公司），活性氧檢測試劑盒（中國碧云天公司），人SW620結(jié)腸癌細(xì)胞購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司（自ATCC引入），900 FORMA恒溫二氧化碳CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司），熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司），流式細(xì)胞儀（美國BD公司），激光掃描共聚焦顯微鏡（德國Leica公司），半導(dǎo)體激光儀（西北大學(xué)光電子技術(shù)重點實驗室）。

1.2 方法

1.2.1 光敏劑準(zhǔn)備和光照處理將Ce6在避光避聲條件下溶解于PBS（pH=7.4）中，質(zhì)量濃度為2 mg/ml，過濾除菌-20℃避光保存?zhèn)溆?。光照各組細(xì)胞加不同濃度Ce6進(jìn)行孵育，使用半導(dǎo)體激光儀垂直照射，光照波長650 nm，輸出功率32 mW，照射劑量6 J/cm2。然后繼續(xù)培養(yǎng)至實驗結(jié)束時進(jìn)行檢測。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組SW620細(xì)胞用含10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺的Leibovitz’s L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、濕度100%、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。研究分實驗組和對照組，對照組設(shè)空白對照和單純光敏劑組。實驗組加入不同濃度的Ce6培養(yǎng)基孵育后進(jìn)行光照。各實驗實施中均避光進(jìn)行，實驗重復(fù)3次。

1.2.3 共聚焦顯微鏡觀察Ce6的亞細(xì)胞定位取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度為1× 105個/ml，取2 ml細(xì)胞懸液接種至激光共聚焦皿中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，將含0.5μg/ml Ce6的培養(yǎng)基1 ml加入激光共聚焦皿中孵育4 h，吸棄培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，各皿分別加入濃度為1μmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ER-TrackerTMGreen探針、溶酶體LysoTracker Deep Red探針、線粒體MitoTracker Green FM探針各1 ml，37℃避光孵育30 min，PBS沖洗細(xì)胞3次，共聚焦顯微鏡下觀察Ce6在細(xì)胞中的亞定位。

1.2.4 熒光顯微鏡觀察活性氧取2 ml密度為1× 105個/ml的SW620細(xì)胞懸液接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)基，PBS沖洗3次后分別加入不同濃度的Ce6（0，0.125，0.25及0.5μg/ml），避光孵育4 h，吸棄培養(yǎng)基，PBS沖洗3次后進(jìn)行光照。激光照射后加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1 h，吸棄培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，每孔加入無血清培養(yǎng)基稀釋的2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2'，7'-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA，1∶1 000）1 ml，陽性對照加入活性氧誘導(dǎo)劑，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，熒光倒置顯微鏡下觀察熒光。Image J軟件分析熒光強(qiáng)度。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡SW620細(xì)胞按4×105個/ml的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)基，PBS沖洗3次后分別加入含0、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0及8.0μg/ml Ce6的培養(yǎng)基，避光孵育4 h，吸棄培養(yǎng)基，PBS沖洗3次后進(jìn)行光照。激光照射后加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，離心收集各組細(xì)胞。測定細(xì)胞周期的各組細(xì)胞加入70%冰乙醇4℃固定過夜，冷PBS洗去固定液，加入RNase（50μg/ml）輕輕混勻后37℃反應(yīng)30 min，加入PI（50μg/ml）4℃避光染色30 min。測定細(xì)胞凋亡的各組細(xì)胞加入AnnexinⅤ和PI各20μl，輕輕混勻后避光染色20 min。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡。

1.2.6 Western blot檢測細(xì)胞Caspase-3、Bcl-2、Beclin 1及LC3B蛋白表達(dá)分組和干預(yù)同前。收集細(xì)胞后用RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。上樣量50μg總蛋白，10% SDS-PAGE膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)至NC膜，用含5%脫脂奶粉的TTBS室溫封閉NC膜2 h，TTBS洗膜3次，每次10 min，加入一抗Caspase-3（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Beclin 1（1∶2 000）、LC3B（1∶3 000）及β-Actin（1∶3 000），完全浸潤NC膜，室溫孵育1 h后，放于4℃過夜，次日TTBS洗膜3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶10 000），室溫孵育45 min，TTBS洗膜3次后ECL試劑曝光、顯影和定影。Image J軟件分析條帶灰度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ce6在SW620細(xì)胞內(nèi)的定位

Ce6與SW620細(xì)胞孵育后，分別加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)探針ER-TrackerTMGreen、溶酶體探針LysoTracker Deep Red、線粒體探針MitoTracker Green FM，共聚焦顯微鏡觀察Ce6主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，其次位于線粒體中，細(xì)胞核和溶酶體中幾乎無分布（見圖1）。

2.2 Ce6-PDT后SW620細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧

如圖2所示，通過熒光顯微鏡觀察，隨著Ce6濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)活性氧綠色熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。不同Ce6濃度組熒光強(qiáng)度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 85.201，P＜0.05）。0 ug/ml Ce6-PDT組與Ce6對照組比較熒光強(qiáng)度無差異（P＞0.05），其余各組與Ce6對照組比較熒光強(qiáng)度有差異（P＜0.05），見表1。

表1 Ce6-PDT后SW620細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧熒光強(qiáng)度比較（n=3±s）

表1 Ce6-PDT后SW620細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧熒光強(qiáng)度比較（n=3±s）

注：1）與Ce6對照組相比，P＞0.05；2）與Ce6對照組相比，P＜0.05

組別熒光強(qiáng)度F值P值0.5μg/mL Ce6對照組19.162±0.608 0μg/mL Ce6-PDT16.886±0.7621）0.125μg/mL Ce6-PDT33.011±3.0142）85.2010.000 0.25μg/mL Ce6-PDT50.482±7.0812）0.5μg/mL Ce6-PDT80.617±5.5342）

表2 Ce6-PDT對SW620細(xì)胞周期的影響（n=3±s）

表2 Ce6-PDT對SW620細(xì)胞周期的影響（n=3±s）

Ce6濃度/（μg/ml）0 0.125 0.25 0.5 1 2 4 8 G0/G1SG2/M 42.233±5.50054.900±2.6006.233±1.404 61.167±4.02830.500±6.2966.900±2.088 52.700±9.77346.300±4.9527.600±2.107 61.467±7.70527.533±4.2107.667±1.856 69.100±9.97117.400±3.31810.200±2.007 70.467±3.43813.267±2.50812.400±3.451 57.067±5.26023.633±5.6348.567±3.592 58.133±4.18630.933±5.3769.900±2.731 F值P值F=5.458 P=0.002 F=22.759 P=0.000 F=1.955 P=0.120

2.3 Ce6-PDT對SW620細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測了Ce6-PDT對SW620細(xì)胞周期的影響，統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果表明，Ce6-PDT可使G0/G1期細(xì)胞比例增加（F=5.458，P＜0.05），S期細(xì)胞比例減少（F=22.759，P＜0.05），G2/M期細(xì)胞比例變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.955，P＞0.05），提示Ce6-PDT能引起G0/G1期阻滯。

2.4 Ce6-PDT對SW620細(xì)胞凋亡的影響

由圖3可以看出，當(dāng)Ce6濃度小于等于1.0μg/ml時，光動力組與無光照組相比細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），Ce6濃度高于1.0μg/ml時，光動力組細(xì)胞凋亡率高于無光照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。無光照組各濃度細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.364，P＞0.05），光動力組各濃度細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=55.085，P＜0.05）。細(xì)胞凋亡圖如圖4所示。

2.5 Ce6-PDT對SW620細(xì)胞凋亡、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，不同濃度Ce6-PDT處理細(xì)胞后，Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)、Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，各濃度相對灰度值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 66.530，P＜0.05；F=51.433，P＜0.05）。LC3B蛋白表達(dá)隨著Ce6濃度的增加先下調(diào)后上調(diào)（F=21.254，P＜0.05）。Beclin 1蛋白表達(dá)各濃度組無明顯改變（F=1.757，P＞0.05）。

圖1 Ce6在SW620細(xì)胞內(nèi)的亞定位

圖2 Ce6-PDT后SW620細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧熒光圖

圖3 Ce6-PDT對SW620細(xì)胞凋亡的影響

圖4 Ce6-PDT誘導(dǎo)SW620細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖

圖5 Ce6-PDT對SW620細(xì)胞凋亡、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

PDT的歷史可追溯到20世紀(jì)初，但直到20世紀(jì)70年代，在有“光動力療法之父”稱譽(yù)的DOUGHERTY[6]的努力下，該法才得到廣泛應(yīng)用。PDT在加拿大、美國、德國及荷蘭等許多國家已成為治療體表及體內(nèi)腫瘤的一種新方法。該方法利用光敏劑特異結(jié)合腫瘤細(xì)胞的性質(zhì)，加之適當(dāng)波長光激活光敏劑產(chǎn)生具有殺傷作用的活性氧，從而達(dá)到治療腫瘤的目的[7]。為了探討Ce6-PDT直接殺傷SW620細(xì)胞的可能機(jī)制，筆者首先研究了Ce6在細(xì)胞中的亞定位及其Ce6-PDT后產(chǎn)生的活性氧。光敏劑與細(xì)胞沒有直接特異性的結(jié)合受體，對于任何一種類型的光敏劑沒有一種固定的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)定位有關(guān)，而光敏劑在細(xì)胞中亞定位不同可能會誘導(dǎo)不同的細(xì)胞死亡通路[8-9]，所以有必要觀察Ce6在SW620細(xì)胞中的亞定位。研究文獻(xiàn)報道的光敏劑亞細(xì)胞定位有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、線粒體、高爾基體或定位于細(xì)胞膜[10-12]。本文應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微成像技術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)Ce6在SW620細(xì)胞中主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，其次位于線粒體中，細(xì)胞核和溶酶體中幾乎無分布。同樣是Ce6在人成纖維細(xì)胞中主要定位于溶酶體[13]，這也提示筆者即使是相同的光敏劑在不同的細(xì)胞中其定位也可能有所不同，引起細(xì)胞死亡的途徑可能存在差異。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Ce6-PDT后SW620細(xì)胞內(nèi)的ROS熒光強(qiáng)度隨著Ce6濃度的增加逐漸增強(qiáng)，這與隨著光敏劑濃度的增加Ce6-PDT對細(xì)胞殺傷作用越強(qiáng)相一致。

有研究資料表明PDT可對細(xì)胞周期產(chǎn)生影響。光敏劑金絲桃素使人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞G0/G1期阻滯，同時伴隨G0/G1檢驗點分子Cyclin E表達(dá)增加和Cyclin A表達(dá)降低[14]。四間羥基苯二氫卟吩[5，10，15，20-meta-tetra（hydroxyphenyl）chlorin，m-THPC] -PDT可使人A-431鱗狀癌細(xì)胞及二羧甲氨基對乙酰氨基三苯基卟吩[5-（4'-（2''-dicarboxymethylamino）acetamidophenyl）-10，15，20-triphenylporphyrin，DTPP]-PDT可使人肺癌A-549細(xì)胞發(fā)生S期阻滯[15-16]。本研究表明隨著Ce6濃度的增加，Ce6-PDT可引起細(xì)胞G0/G1期阻滯，S期細(xì)胞比例逐漸減少，這可能是筆者前期發(fā)現(xiàn)隨著劑量的增加，Ce6-PDT使細(xì)胞增殖逐漸受抑制的原因之一，但本文尚未涉及細(xì)胞周期阻滯機(jī)制的探討。m-THPC-PDT使A-431細(xì)胞周期阻滯與p21 mRNA和蛋白表達(dá)增加有關(guān)[15]，Ce6-PDT引起SW620細(xì)胞周期阻滯是否與上述周期調(diào)控關(guān)鍵分子有關(guān)有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

PDT可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、自噬或壞死引起細(xì)胞死亡，這些死亡方式可能會同時發(fā)生。參與凋亡性細(xì)胞死亡的信號通路常常包括Bcl-2、Caspase家族蛋白。當(dāng)PDT無法誘導(dǎo)凋亡性細(xì)胞死亡通路激活時，PDT可能會誘發(fā)自噬性或壞死性細(xì)胞死亡。這些死亡機(jī)制的誘導(dǎo)與光敏劑本身特性、光敏劑劑量及細(xì)胞種類均有關(guān)[9，17-19]。無論高劑量或低劑量，定位于線粒體的m-THPC均可引起細(xì)胞自噬和凋亡[15]。Ce6及其衍生物可引起人血管平滑肌細(xì)胞凋亡及肺腺癌ASTC-a-1細(xì)胞粒體途徑細(xì)胞凋亡[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)高劑量Ce6-PDT可引起SW620細(xì)胞凋亡率升高，Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，提示Ce6-PDT可引起凋亡性細(xì)胞死亡。LC3B蛋白表達(dá)隨著Ce6濃度的增加先下調(diào)后上調(diào)，推測可能在低劑量光動力時自噬起到保護(hù)細(xì)胞作用，在高劑量時和凋亡共同引起細(xì)胞死亡。這也是自噬在光動力治療腫瘤中的雙刃劍作用的體現(xiàn)[22]。接下來筆者打算探討Ce6-PDT光動力殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞中自噬和凋亡的關(guān)系及其對誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的影響，為進(jìn)一步提高療效尋找更合適的光動力治療方案提供依據(jù)。

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Photodynamic effects of chlorin e6 on cell cycle and apoptosis of human colon cancer SW620 cells*

Ling KANG1,Jun XU2,Jie ZHANG1,Yan MA1
(1.Department of Occupational and Environmental Health,College of Public Health,Xinjiang Medical University,Urumqi,Xinjiang 830011,P.R.China;2.Department of Periodontics and Oral Medicine,the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi,Xinjiang 830011,P.R.China)

【Objective】To investigate the effects of chlorin e6-photodynamic therapy(Ce6-PDT)on cell cycle and apoptosis of human colon cancer SW620 cells,and to explore the mechanism of Ce6-PDT in killing colorectal cancer cell.【Methods】Intracellular distribution of Ce6 in SW620 cells was monitored by using Leica confocal laser scanning microscope(LSCM).Generation of reactive oxygen species(ROS)caused by Ce6-PDT(0,0.125,0.25,0.5, 1.0,2.0,4.0 and 8.0 μg/ml)was observed with fluorescence microscope.Cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry.Western blot was employed to analyze the expression of Caspase-3,Bcl-2,Beclin 1 and LC3B.【Results】LSCM showed that Ce6 was mainly distributed within the endoplasmic reticulum and mitochondria,with nearly no distribution in the nucleus and lysosome in SW620 cells.Exposure to Ce6-PDT induced ROS production in SW620.Flow cytometry results indicated that SW620 cells presented G0/G1 phase arrest,obvious decrease of S phase ratio,and higher rate of apoptosis,in a dose-dependent manner(P＜0.05).Relative gray value of caspase-3 and Bcl-2 protein expression has changed in cells treated with Ce6-PDT,and each group difference was statisticallysignificant(P＜0.05).Expression of LC3B protein down-regulated firstly and up-regulated then with the increase of concentration of Ce6(P＜0.05).【Conclusion】Induction of cell cycle arrest and apoptosis may be involved in Ce6-PDT in inhibiting cell proliferation and killing SW620 cells,and caspase-3,Bcl-2 and LC3B may participate in killing SW620 cells of Ce6-PDT.

colorectal cancer;chlorin e6;photodynamic therapy;apoptosis;autophagy

R730.57

A

1005-8982（2015）31-0010-07

2015-05-07

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金-醫(yī)學(xué)聯(lián)合基金項目（No：2014211C003）