杜冉，張會麗，趙莘瑜，牛瑞娜

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052）

·論著·

頸動脈粥樣硬化患者外周血中CD36表達(dá)水平及與Toll樣受體4信號的相關(guān)性

杜冉，張會麗，趙莘瑜，牛瑞娜

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052）

目的觀察頸動脈粥樣硬化（AS）患者外周血中CD36水平，并探討其與人單核細(xì)胞Toll樣受體4（TLR4）信號的相關(guān)性。方法選取該院治療的頸AS患者40例為AS組，以同期來該院體檢的40例健康者為對照組。收集兩組患者外周血后采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及Western blot檢測CD36水平和TLR4信號激活的相關(guān)因子。采用匹伐他汀抑制AS組患者單核細(xì)胞中的CD36水平后，檢測AS組患者單核細(xì)胞中相關(guān)因子的表達(dá)。結(jié)果與對照組比較，AS組患者外周血中CD36的mRNA及蛋白水平顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=41.503和27.112，P=0.000）。AS組患者外周血中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）為（50.2± 3.1）pg/ml，顯著高于對照組[（33.5±2.8）pg/ml]；AS組患者外周血中白介素-6（IL-6）為（54.1±2.4）pg/ml，顯著高于對照組[（32.8±2.1）pg/ml]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=42.242，P=0.000）；AS組患者外周血中核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）mRNA水平顯著高于對照人群，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=34.411，P=0.000）。CD36 mRNA水平與患者血清TNF-α、IL-6及NF-κB mRNA呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（r=0.641、0.579和0.659，P＜0.05）。采用匹伐他汀抑制AS組患者體內(nèi)CD36表達(dá)后，AS組患者外周血中TNF-α和IL-6蛋白及NF-κB mRNA水平顯著低于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=17.277、10.022和15.360，P=0.000）。結(jié)論AS患者外周血中CD36高表達(dá)，并與TLR4信號相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子水平相關(guān)，提示CD36可能通過影響TLR4信號參與AS的發(fā)生、發(fā)展。

動脈粥樣硬化；CD36；Toll樣受體4

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）可引起冠心病和腦梗死，嚴(yán)重危害人類生命健康[1]。目前在動脈粥樣硬化的發(fā)病過程中，病原特異性Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）信號的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全清楚，CD36是否參與血管病變的TLR4信號炎癥反應(yīng)的相關(guān)研究報道較少。因此，本研究旨在探討與分析CD36對血管病變患者TLR4信號炎癥因子的影響，以期為動脈粥樣硬化的診療提供實(shí)驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1病例資料

選取2011年1月-2014年1月在本院行頸動脈彩色B超（coronary arteriography，CAG）確診為AS的患者40例為AS組，選取同期40例健康體檢健康者為對照組。AS組男性15例，女性25例；年齡48～66歲，平均（53.54±7.41）歲。對照組男性17例，女性23例；年齡51～67歲，平均（52.38±8.27）歲。兩組患者的一般情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2方法

1.2.1酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定血清中炎癥因子水平清晨空腹時抽取兩組患者外周靜脈血5 ml，加入乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝劑，2 h內(nèi)4℃、4 000 g離心20 min，提取上層血清備用。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）與白介素-6（Interleukin-6，IL-6）的ELISA試劑盒購自美國eBioscience公司，檢測流程及步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測血清中相關(guān)因子的mRNA水平取200μl全血，加入1 ml Trizol（南京生興生物技術(shù)有限公司）充分勻漿。按照說明書進(jìn)行操作，抽提總RNA溶于20μl焦碳酸二乙酯處理水，經(jīng)紫外分光光度計進(jìn)行定量分析。采用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，置入-20℃冰箱冷凍保存。采用RT-PCR檢測外周血中核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）和CD36的mRNA水平。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸7 min。CD36引物序列為：正向引物5'-CAGATGA CGTGGCAAAGAAC-3'，反向引物：5'-TGGCTCCATT GGGCTGTA-3'；NF-κB p50引物序列為：正向引物5'-CCTGCTCCTGGAGGGTGACGCC-3'，反向引物：5'-GTATGTCAAATACCTGCCAGTTG-3'；內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶引物序列為：正向引物5'-ATCTG GCACCACACCTTC-3'，反向引物：5'-AGCCAGGTCC AGACGCA-3'。采用美國ABI公司的7300型號Real Time PCR儀器進(jìn)行分析，結(jié)果用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對定量分析。

1.2.3全血單核細(xì)胞提取每1×108個外周血單核細(xì)胞加入200μl CD14磁珠抗體（德國美天旎公司）和800μl緩沖液（含有10%胎牛血清和2 mol/L EDTA，4℃預(yù)冷），15 ml離心管中充分混勻，4℃孵育15 min。加入1～2 ml預(yù)冷緩沖液，1 000 r/min離心后棄上清液，加入0.5 ml緩沖液并吹打成單細(xì)胞懸液。在磁性細(xì)胞分離器磁力架上將上述細(xì)胞懸液加入至細(xì)胞分離柱中，用緩沖液沖洗分離出CD14+細(xì)胞（陰選）。

1.2.4Western blot檢測蛋白水平收取細(xì)胞后，加入1×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）細(xì)胞裂解液，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium dodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）電泳，110 V電壓轉(zhuǎn)膜100 min，37℃封閉后，加兔抗人CD36（美國Bio Legend公司）4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的小鼠抗兔二抗（南京生興生物技術(shù)有限公司）（1∶1 500稀釋）37℃孵育30 min，內(nèi)參蛋白選用美國Sigma公司的抗人β-actin（1∶3 000稀釋），孵育后磷酸鹽吐溫緩沖液洗膜3次，進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較為成組t檢驗，前后比較為配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1外周血CD36表達(dá)水平

與對照組比較，AS組患者外周血中CD36 mRNA水平顯著提高（見圖1A），差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（4.03± 0.44）vs（1.00±0.14），t=41.503，P=0.000]；與對照組比較，AS組患者外周血中CD36蛋白水平顯著提高（見圖1B、C），差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（3.32±0.52）vs（1.00±0.15），t=27.112，P=0.000]。

圖1 兩組患者外周血CD36水平比較

2.2血清TLR4信號相關(guān)因子水平比較

進(jìn)一步檢測AS組患者TLR4信號激活相關(guān)因子TNF-α和IL-6水平，結(jié)果顯示，AS組患者外周血中TNF-α為（50.2±3.1）pg/ml，顯著高于對照組[（33.5±2.8）pg/ml]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=25.284，P= 0.000）；AS組患者外周血中IL-6為（54.1±2.4）pg/ml，顯著高于對照組[（32.8±2.1）pg/ml]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=42.242，P=0.000）。AS組患者外周血中NF-κB mRNA顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（3.41±0.39）vs（1.00±0.21），t=34.411，P=0.000]。見圖2。

圖2 兩組患者外周血TNF-α、IL-6及NF-κB mRNA水平比較

2.3AS組患者CD36水平與TLR4信號相關(guān)因子的相關(guān)性

結(jié)果顯示，AS組患者外周血中CD36 mRNA表達(dá)水平與患者血清TNF-α、IL-6及TLR4信號轉(zhuǎn)錄因子NF-κB mRNA呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（r=0.641、0.579和0.659，P＜0.05）。

2.4匹伐他汀治療前后AS組患者TLR4信號炎癥因子的變化

AS組患者口服匹伐他汀4mg/d抑制外周血中CD36水平。治療4周后，AS組患者外周血中TNF-α和IL-6分別為（42.6±3.1）和（41.9±3.1）pg/ml，顯著低于治療前的（53.8±1.8）和（52.2±4.0）pg/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=17.277和10.022，P=0.000）；采用匹伐他汀治療后，外周血中NF-κB mRNA水平顯著低于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（0.49± 0.09）vs（1.00±0.17），t=15.360，P=0.000]。見圖3。

圖3 匹伐他汀治療前后AS組患者TLR4信號炎癥因子的變化

3 討論

TLR4是TLRs家族中一類最重要的模式識別受體，不僅是炎癥反應(yīng)過程的核心受體，同時還是內(nèi)、外源性抗原識別的核心及信號轉(zhuǎn)錄的起始蛋白[2]。TLR4的信號傳導(dǎo)途徑根據(jù)接頭蛋白的不同可分為髓樣分化蛋白（myeloid differentiation primary response protein 88，MyD88）依賴性和MyD88非依賴性途徑。其中在TLR4信號的MyD88依賴性途徑中，MyD88可以通過死亡結(jié)構(gòu)域間的相互作用招募IL-1受體相關(guān)激酶家族的成員，進(jìn)一步誘導(dǎo)下游分子TNF受體相關(guān)因子6磷酸化，最終誘導(dǎo)NF-κB的活化[3-4]。大量研究認(rèn)為，動脈粥樣硬化是以動脈血管內(nèi)膜脂質(zhì)沉積為基本病變的慢性炎癥反應(yīng)，該炎癥反應(yīng)可能涉及TLR4的應(yīng)答[5-7]。然而，TLR4信號在AS患者發(fā)病過程中的確切作用尚未完全明了。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AS患者外周血中的TLR4信號相關(guān)分子如TNF-α、IL-6及NF-κB水平顯著高于正常人群。進(jìn)一步說明在AS發(fā)生、發(fā)展過程中，炎癥因子的產(chǎn)生可能是通過MyD88依賴性的TLR4信號途徑來發(fā)揮作用。動物模型研究認(rèn)為，當(dāng)阻斷載脂蛋白E（apo lipoprotein E，ApoE）缺陷小鼠的TNF-α后，可以有效地阻止AS形成[8]；且ApoE缺陷小鼠自發(fā)的AS形成伴隨著高水平IL-6的產(chǎn)生[9]。TUNG等[10]研究發(fā)現(xiàn)，AS患者中TLR4信號被激活，且通過MyD88依賴的信號途徑活化NF-κB分子來發(fā)揮功能。以上報道與本研究結(jié)果一致。

大量研究表明，血脂及低密度脂蛋白增高是AS的重要誘導(dǎo)因素，因此降脂藥物被廣泛應(yīng)用于AS的臨床治療。匹伐他汀是一類通過拮抗膽固醇合成途徑中的限速酶——3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶，阻礙肝臟的膽固醇合成的藥物。有研究認(rèn)為，匹伐他汀可以抑制人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞上CD36的表達(dá)[11]。因此，筆者進(jìn)一步觀察AS患者服用匹伐他汀后，TLR4信號炎癥因子的變化，結(jié)果顯示，服用匹伐他汀后，AS患者外周血中TNF-α、IL-6及NF-κB水平顯著降低。說明匹伐他汀對AS患者體內(nèi)CD36介導(dǎo)的TLR4信號炎癥因子有重要的抑制功能，提示匹伐他汀可以作為一種治療AS患者體內(nèi)過度激活炎癥反應(yīng)的藥物。該臨床治療功能可能與匹伐他汀具有強(qiáng)大調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用有關(guān)[12]。FEBBRAIO等[13]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)基因敲除ApoE缺陷小鼠CD36后，能顯著降低AS的發(fā)展，進(jìn)一步證明本研究結(jié)果。

綜上所述，AS患者外周血中TLR4信號炎癥因子明顯升高，說明TLR4在AS的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究首次發(fā)現(xiàn)匹伐他汀可抑制AS患者TLR4信號介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，對AS的治療可能有一定的指導(dǎo)意義。

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（申海菊 編輯）

Expression of CD36 in peripheral blood of atherosclerosis patients and its relation to TLR4 signaling

Ran DU,Hui-li ZHANG,Shen-yu ZHAO,Rui-na NIU
(The First Affiliated Hospital,Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450052,P.R.China)

【Objective】To observe the levels of CD36 in peripheral blood of atherosclerosis(AS)patients, and explore the relationship between CD36 and toll-like receptor(TLR4)signaling in atherosclerosis.【Methods】The study group included 40 cases of atherosclerosis patients in our hospital and the control group included 40 healthy volunteers.RT-PCR was used to detect the expression of CD36,and Western blot used to detect the protein levels related to TLR4 signal activation.In addition,Pitavastatin was used to inhibit the expression of CD36 in the AS patients,and then the TLR4 signal activation related genes and proteins were detected.【Results】Compared with the control group,the levels of CD36 mRNA and protein in the AS patients were significantly increased,the differences were statistically significant(t=41.503 and 27.112,P= 0.000).The serum TNF-α level in the peripheral blood of the AS patients was(50.2±3.1)pg/ml which was significantly higher than(33.5±2.8)pg/ml in the control group(t=25.284,P=0.000).The serum IL-6 level in the patients with AS was(54.1±2.4)pg/ml which was significantly higher than(32.8±2.1)pg/ml in the control group(t=42.242,P=0.000).The level of NF-κB mRNA in the peripheral blood of the AS patientswas significantly higher than that of the control group(t=34.411,P=0.000).In addition,there were positive correlations between CD36 mRNA level and TNF－α,IL－6 and NF－κB mRNA levels(r=0.641,0.579 and 0.659,P＜0.05).After using Pitavastatin to inhibit CD36 expression in the AS patients,the serum levels of TNF－α,IL－6 and NF－κB mRNA were significantly lower than those before inhibition(t=17.277,10.022 and 15.360;P=0.000).【Conclusions】CD36 is highly expressed in patients with AS,and CD36 expression is significantly associated with TLR4 signal related transcription factors and cytokine levels in AS patients,suggesting that CD36 may be involved in the occurrence and development of AS by affecting TLR4 signaling.

atherosclerosis;CD36;toll－like receptor 4

R543.4

A

1005-8982（2015）32-0031-05

2015-03-20