劉崇梅，王彩霞，陳鳳，于惠芝，王婕，陽娟

（湖南省岳陽市二人民醫(yī)院1.病理科，2.腫瘤科，湖南 岳陽 414000）

·論著·

胸腔積液患者細(xì)胞DNA異倍體、microRNA-192及其相關(guān)因子對非小細(xì)胞肺癌的診斷意義*

劉崇梅1，王彩霞1，陳鳳1，于惠芝2，王婕1，陽娟1

（湖南省岳陽市二人民醫(yī)院1.病理科，2.腫瘤科，湖南 岳陽 414000）

目的探討聯(lián)合檢測胸腔積液細(xì)胞DNA異倍體、microRNA-192（miRNA-192）含量及其相關(guān)因子在肺癌臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值，以期提高良、惡性胸腔積液的鑒別能力。方法應(yīng)用受試者工作特性曲線（ROC）對61例肺癌及70例良性腫瘤患者的胸水細(xì)胞DNA異倍體、miRNA-192含量、血清人細(xì)胞角蛋白19片段抗原21-1（CYFRA21-1）、吸煙史及卡氏功能狀態(tài)量表（KPS量表）的檢測結(jié)果進(jìn)行分析和評價(jià)。結(jié)果兩組患者臨床資料單因素分析顯示，吸煙史、KPS量表、CYFRA21-1、胸水細(xì)胞miRNA-192及胸水細(xì)胞DNA異倍體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。胸水細(xì)胞miRNA-192診斷肺非小細(xì)胞癌（NSCLC）的曲線下面積（AUC）= 0.735、約登指數(shù)（YI）=0.408；胸水細(xì)胞DNA異倍體診斷NSCLC的AUC=0.806，YI=0.556；聯(lián)合吸煙史、KPS量表、CYFRA21-1診斷NSCLC的AUC=0.839，YI=0.596。將胸水細(xì)胞miRNA-192和DNA異倍體納入診斷體系，5項(xiàng)危險(xiǎn)因素聯(lián)合診斷NSCLC的AUC=0.867，YI=0.628。結(jié)論吸煙史、KPS量表、CYFRA21-1、胸水細(xì)胞miRNA-192及胸水細(xì)胞DNA異倍體的聯(lián)合檢測有助于對良、惡性胸腔積液進(jìn)行鑒別診斷，提升NSCLC的診斷價(jià)值。

胸腔積液；DNA異倍體；miRNA-192；非小細(xì)胞性肺癌

臨床上胸腔積液常見、多發(fā)，病因復(fù)雜多樣，可由胸膜、肺部多種疾病引發(fā)，如胸膜炎、肺結(jié)核、惡性腫瘤等。臨床上約5%～10%惡性胸腔積液患者的原發(fā)腫瘤病灶無法明確。近年來，腫瘤標(biāo)志物的應(yīng)用提高了肺癌的診斷率。但某些腫瘤標(biāo)志物單項(xiàng)檢測的敏感性和特異性并不高。近年來，國內(nèi)外學(xué)者開展多種腫瘤標(biāo)志物的測定，以協(xié)助該病的診斷及療效觀察[1]。MicroRNA（miRNA）是19～22核苷酸大小的非編碼RNA，是內(nèi)源性表觀基因表達(dá)的調(diào)控者，可能成為潛在的生物標(biāo)記物。目前，檢測這些分子的手段包括實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real time-polymerase chain reaction，RT-PCR）、基因芯片、原位雜交和基因測序[2]。本文探討胸腔積液細(xì)胞DNA異倍體聯(lián)合miRNA-192對肺非小細(xì)胞癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的診斷意義，并將上述指標(biāo)與肺癌常見的危險(xiǎn)因素，包括吸煙史、卡氏功能狀態(tài)量表（karnofsky perfomance status，KPS）、血清人細(xì)胞角蛋白19片段抗原21-1（serum cytokeratin 19 fragments，CYFRA21-1）等項(xiàng)目進(jìn)行對比，探討聯(lián)合檢測在肺癌臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值，以期提高良、惡性胸腔積液的鑒別能力。

1 資料與方法

1.1一般資料

收集本院2013年9月-2014年7月肺癌合并胸腔積液61例住院患者的血清及胸水樣本。男性43例，女性18例；平均年齡53.8歲。其中肺鱗癌31例，腺癌20例，腺鱗癌3例，大細(xì)胞癌7例。同時(shí)采集70例良性腫瘤患者的血清及胸水樣本作為對照組。男性30例，女性40例；平均年齡54.4歲。所有診斷經(jīng)組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)證實(shí)。所有患者入院后登記一般情況、吸煙史。根據(jù)患者當(dāng)前狀況完成KPS量表評分，該量表分為10級，閾值0～100分。

1.2檢測方法

1.2.1血清CYFRA21-1清晨空腹抽靜脈血，離心取上清液待測。采用電化學(xué)發(fā)光法檢測血清CYFRA21-1，使用Cobas E411免疫分析儀和配套試劑（德國Roche公司）質(zhì)控進(jìn)行檢測。

1.2.2細(xì)胞DNA定量分析所有Feulgen染色片經(jīng)MotiCytometer全自動(dòng)細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)（廈門Motic公司）進(jìn)行掃描處理。根據(jù)系統(tǒng)診斷軟件所做的細(xì)胞DNA異倍體分析結(jié)果，分為3種情況：①正常細(xì)胞的DNA指數(shù)（DNA index，DI）為1，即為二倍體細(xì)胞（diploid cell，2C），無異倍體細(xì)胞和異常細(xì)胞峰；②4C細(xì)胞數(shù)＞5%被檢測細(xì)胞總數(shù)，但無異倍體細(xì)胞診斷為增生；③有≥3個(gè)DI≥2.5的細(xì)胞或有異倍體細(xì)胞峰診斷為陽性。

1.2.3miRNA-192測定①抽取患者胸腔積液，常規(guī)留取胸水樣本50 ml置于肝素瓶中充分混勻。70μm尼龍篩網(wǎng)過濾至離心管，4℃、1 500 r/min離心10min，去除上清液。加入磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）重懸制備細(xì)胞懸液，于-80℃冰箱冷凍保存。細(xì)胞懸液濃度調(diào)至1×106個(gè)/ml，置于-80℃冰箱冷凍保存，嚴(yán)格按照miRNA提取分離試劑（美國ABI公司）說明書提取胸腔積液中的miRNA，用核酸蛋白分析儀（美國Bio Rad公司）測定RNA的純度和濃度。②逆轉(zhuǎn)錄miRNA：引物購自美國ABI公司。取焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）16μl、提取的RNA 1μl、miRNA-192或U6的特異性引物3μl，70℃水浴5 min后立即取出置于冰水浴5 min。向每個(gè)逆轉(zhuǎn)錄體系中加入5×逆轉(zhuǎn)錄酶禽成髓細(xì)胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）緩沖液10μl、RNasin（40 u/μl）1μl、逆轉(zhuǎn)錄酶AMV（10 u/μl）1μl、三磷酸脫氧核糖核苷酸（de oxyribonucleoside-5'-triphosphate，dNTPs）（2.5mmol/L）4μl、DEPC 14μl，42℃反應(yīng)60 min，95℃滅活5 min，反應(yīng)產(chǎn)物置于-20℃冰箱冷凍保存。使用Applied Biosystems-7500 RT-PCR儀測定樣本中的miRNA-192，反應(yīng)體系總體積25μl，具體反應(yīng)體系組成如下：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物（待測樣品）或三蒸水（空白對照組）5μl、5×PCR反應(yīng)緩沖液5μl、250 mmol氯化鎂MgCl20.5μl、10 mmol dNTPs 0.75μl、5 u/μl Taq聚合酶0.25μl，正、反向miRNA-192引物各0.5μl，然后用三蒸水補(bǔ)足至25μl[3]。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃延伸1 min，共50個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)收集熒光，并按照每提高0.3℃收集1次熒光的方式做熔解曲線。PCR儀自動(dòng)檢測熒光值，以20.56μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品濃度，光密度260（optical density 260，OD260）/OD280比值為2.18倍，稀釋107、106、105、104、103做標(biāo)準(zhǔn)曲線。③在RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，計(jì)算機(jī)自動(dòng)輸出每個(gè)反應(yīng)體系的擴(kuò)增曲線、熔解曲線和CT值。以U6RNA作為內(nèi)參，以N=2-ΔCt表示胸水miRNA相對表達(dá)量，其中ΔCt表示miRNA-192與內(nèi)參U6RNA的Ct差。用分析軟件依據(jù)上述公式自動(dòng)計(jì)算待測樣品miRNA-192的相對含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用逐步條件Logistic回歸模型進(jìn)行多因素回歸分析，對單因素比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的危險(xiǎn)因素進(jìn)行校正，分析相關(guān)危險(xiǎn)因素（自變量）與患者病因診斷（自變量）的相關(guān)性，計(jì)算回歸系數(shù)最大似然估計(jì)值（b）、最大似然估計(jì)值的標(biāo)準(zhǔn)誤[SE（b）]、Wald檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量值[Wald（χ2）]、比值比的估算值（OR）、比值比估算值的95%可信區(qū)間（OR 95%CI）。選用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）評價(jià)檢測指標(biāo)的診斷價(jià)值，計(jì)算ROC曲線下面積（area under curve，AUC）、曲線下面積的95%可信區(qū)間（AUC 95%CI），依照公式計(jì)算危險(xiǎn)因素的約登指數(shù)（Youden index，YI）：YI=敏感性+特異性-1。設(shè)定AUC 0.5～0.7時(shí)診斷價(jià)值較低，AUC 0.7～0.9時(shí)診斷價(jià)值中等，AUC＞0.9時(shí)診斷價(jià)值較高，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組患者的臨床資料比較

單因素比較顯示，兩組患者吸煙史、KPS量表、CYFRA21-1、胸水細(xì)胞miRNA-192、胸水細(xì)胞DNA異倍體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患者的臨床資料比較

2.2逐步條件Logistic回歸分析

根據(jù)臨床資料單因素分析結(jié)果，采取逐步引入法，以組別為因變量，以單因素比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)為自變量。采用逐步向前法建立Logistic回歸方程，變量引入水準(zhǔn)設(shè)置為0.05，剔除水準(zhǔn)設(shè)置為0.10。依照自變量作用的大小進(jìn)行排序并依次引入Logistic回歸方程，直至作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義為止，隨即擬合主效應(yīng)模型，分析上述指標(biāo)與病因診斷的相關(guān)性。結(jié)果顯示，吸煙史、KPS量表、CYFRA21-1、胸水細(xì)胞miRNA-192及胸水細(xì)胞DNA異倍體5個(gè)變量進(jìn)入最終回歸模型。其中KPS量表為診斷NSCLC的保護(hù)因素，其余4項(xiàng)指標(biāo)為診斷NSCLC的危險(xiǎn)因素。最終回歸模型的變量及參數(shù)見表2。

表25 種因素的Logistic回歸分析

2.3各項(xiàng)危險(xiǎn)因素對NSCLC的診斷價(jià)值

以敏感性為縱坐標(biāo)，以誤診率即1-特異性為橫坐標(biāo)，分別繪制不同危險(xiǎn)因素的ROC曲線以驗(yàn)證其診斷效能。

2.3.1胸水細(xì)胞miRNA-192和DNA異倍體聯(lián)合診斷胸水細(xì)胞miRNA-192診斷NSCLC的AUC= 0.735[95%CI（0.623，0.773），P＜0.05]，YI=0.408。胸水細(xì)胞DNA異倍體診斷NSCLC的AUC=0.806[95%CI（0.736，0.835），P＜0.05]，YI=0.556。見圖1。

圖1 胸水細(xì)胞miRNA-192和DNA異倍體診斷NSCLC的ROC曲線

2.3.2吸煙史、KPS量表及CYFRA21-1聯(lián)合診斷聯(lián)合吸煙史、KPS量表、CYFRA21-1 3項(xiàng)指標(biāo)診斷NSCLC的AUC=0.839[95%CI（0.789，0.871），P＜0.05]，YI=0.596。見圖2。

圖2 吸煙史、KPS量表、CYFRA21-1聯(lián)合診斷NSCLC的ROC曲線

2.3.3吸煙史、KPS量表、CYFRA21-1、胸水細(xì)胞miRNA-192及胸水細(xì)胞DNA異倍體聯(lián)合診斷將5項(xiàng)因素聯(lián)合應(yīng)用診斷NSCLC的AUC=0.870 [95%CI（0.802，0.910），P＜0.05]，YI=0.628。各項(xiàng)危險(xiǎn)因素的ROC曲線相關(guān)指標(biāo)見表3和圖3。

表3 各項(xiàng)危險(xiǎn)因素的ROC曲線相關(guān)指標(biāo)

圖3 吸煙史、KPS量表、CYFRA21-1、胸水細(xì)胞miRNA-192及胸水細(xì)胞DNA異倍體聯(lián)合診斷NSCLC的ROC曲線

3 討論

研究資料顯示，約50%肺癌患者在疾病過程中出現(xiàn)胸腔積液，臨床上常用生物化學(xué)常規(guī)、脫落細(xì)胞學(xué)及腫瘤標(biāo)志蛋白等方法鑒別良、惡性腫瘤，并盡早排除惡性胸腔積液[4]。脫落細(xì)胞學(xué)檢查尋找惡性細(xì)胞是目前臨床上診斷惡性胸腔積液的金標(biāo)準(zhǔn)，文獻(xiàn)報(bào)道其敏感性局限于70%左右。胸腔積液中常用的具有診斷意義的腫瘤標(biāo)志蛋白有癌胚抗原、糖類抗原153（carbohydrate antigen-153，CA-153）、CA-199、CA-125、CA-724及CYFRA21-1[5]，其可能有助于診斷惡性胸腔積液，但特異性較差。近來DNA定量、游離mRNA的表達(dá)水平也被用于惡性胸腔積液的診斷研究，由于其對腫瘤類型診斷的精確性欠佳，臨床上尚未廣泛應(yīng)用。因此，尋找胸腔積液中穩(wěn)定存在、對患者創(chuàng)傷小、特異性高、可重復(fù)性高、出現(xiàn)較早的標(biāo)志物對良、惡性腫瘤的鑒別意義重大。不僅有助于盡早確診惡性胸腔積液，而且有助于臨床上對惡性胸腔積液患者盡早實(shí)施最佳治療方案，減輕患者病痛[6]。

近年來，臨床上應(yīng)用細(xì)胞DNA定量分析新方法鑒別惡性與炎性胸、腹水。其與細(xì)胞學(xué)診斷比較，敏感性高；與細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查相結(jié)合，可避免漏診，為臨床提供更明確的診治依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)中肺癌患者胸水細(xì)胞DNA異倍體的Logistic回歸分析顯示，其診斷NSCLC的AUC=0.806，說明該因素具有良好的診斷價(jià)值。XIE等[7]首次證明胸腔積液中游離miRNA可作為鑒別良、惡性胸腔積液的潛在指標(biāo)，由此推測胸腔積液中miRNA的表達(dá)量可以作為良、惡性胸腔積液的鑒別指標(biāo)。HAN等[8]利用RT-PCR檢測良性胸腔積液及肺腺癌相關(guān)胸腔積液中miRNA的表達(dá)含量，發(fā)現(xiàn)miR-198有可能作為區(qū)分肺腺癌惡性胸腔積液及良性胸腔積液的鑒別指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，惡性胸腔積液中miRNA-192的表達(dá)明顯高于對照組。ROC曲線分析提示，胸水細(xì)胞miRNA-192診斷NSCLC的AUC=0.735。Logistic回歸分析表明，miRNA-192的表達(dá)水平可以作為良、惡性胸腔積液的鑒別指標(biāo)。

近年來研究顯示，聯(lián)合檢測腫瘤標(biāo)志物對肺癌診斷有較好的應(yīng)用價(jià)值，運(yùn)用Logistic回歸分析和ROC曲線綜合分析可提高肺癌診斷的準(zhǔn)確性[9]。本實(shí)驗(yàn)就NSCLC患者的胸水細(xì)胞miRNA-192和DNA異倍體與其他危險(xiǎn)因素的相關(guān)性進(jìn)行研究。多因素Logistic回歸分析表明，吸煙史、胸水細(xì)胞DNA異倍體陽性、KPS量表評分降低、CYFRA21-1及胸水細(xì)胞miRNA-192含量升高為診斷NSCLC的的獨(dú)立敏感因素。通過繪制上述敏感因素的ROC曲線顯示，胸水細(xì)胞miRNA-192和DNA異倍體的AUC分別為0.735和0.806，說明這兩項(xiàng)敏感因素對NSCLC具有良好的診斷價(jià)值。此外，聯(lián)合吸煙史、KPS量表、CYFRA21-1 3項(xiàng)指標(biāo)診斷NSCLC的AUC=0.839，YI=0.596；在該基礎(chǔ)上加入胸水細(xì)胞miRNA-192和DNA異倍體聯(lián)合診斷，5項(xiàng)敏感指標(biāo)的AUC=0.870，YI=0.6281，較加入前明顯升高，進(jìn)一步體現(xiàn)胸水細(xì)胞miRNA-192和DNA異倍體對NSCLC的診斷價(jià)值。

綜上所述，胸水細(xì)胞miRNA-192和DNA異倍體是NSCLC的獨(dú)立敏感因素，單項(xiàng)檢測指標(biāo)已具有良好的診斷價(jià)值。其與吸煙史、KPS量表、CYFRA21-1聯(lián)合檢測有助于對良、惡性胸腔積液進(jìn)行鑒別診斷，增加NSCLC的診斷價(jià)值。

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（童穎丹 編輯）

Combined detection of pleural effusion cell DNA aneuploidy and microRNA-192 and its related factors in diagnosis of non-small cell lung cancer*

Chong－mei LIU1,Cai－xia WANG1,Feng CHENG1,Hui－zhi YU2,Jie WANG1,Juang YANG1
(1.Department of Pathology,2.Department of Oncology,the Second People's Hospital of Yueyang,Yueyang,Hunan 414000,P.R.China)

【Objective】To study the diagnostic value of combined detection of pleural effusion cell DNA aneuploidy and the content of microRNA－192(miRNA－192)and its related factors so as to improve the ability of differentiating benign and malignant pleural effusion.【Methods】The smoking history,Karnofsky performance status(KPS)scale,serum cytokeratin 19 fragments(CYFRA21－1),pleural effusion cell miRNA－192 and DNA aneuploidy of 61 patients with non－small cell lung cancer(NSCLC)and 70 patients with benign lung disease control were detected and evaluated by ROC curve.【Results】The univariate analysis of clinical information of the two groups of patients showed that there were significant differences in smoking history,KPS scale,CYFRA21－1,pleural effusion cell DNA aneuploidy and miRNA－192(P＜0.05).In diagnosing NSCLC,AUC=0.735,Youden index(YI)=0.408 for pleural effusion cell miRNA－192;AUC= 0.806,YI=0.556 for pleural effusion cell DNA aneuploidy;and AUC=0.839,YI=0.596 for a combination of smoking history,KPSscaleandCYFRA21－1.WhenthepleuraleffusioncellmiRNA－192andDNA aneuploidy were included into the diagnostic system,AUC=0.867,YI=0.628 using the five risk factors forcombined diagnosis of NSCLC.【Conclusion】Combined detection of smoking history,KPS scale,CYFRA21-1, pleural effusion cell miRNA-192 and DNA aneuploidy is favorable for identifying benign and malignant pleural effusion,which is associated with a significantly increased diagnostic value of NSCLC.

pleural effusion;DNA aneuploidy;microRNA-192;non-small cell lung cancer

R734.2

A

1005-8982（2015）32-0026-05

2015-06-25

湖南省科技廳科技資助項(xiàng)目（No：2014SK3144）