王艷莎，季英磊，王濤，吳林琳，費成平，劉夷嫦，谷振勇

（南通大學醫(yī)學院法醫(yī)學系，江蘇南通 226001）

·論著·

HO-1對脂多糖誘導大鼠肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的作用

王艷莎，季英磊，王濤，吳林琳，費成平，劉夷嫦，谷振勇

（南通大學醫(yī)學院法醫(yī)學系，江蘇南通 226001）

目的探討抗氧化蛋白血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導大鼠肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響。方法大鼠正常肝細胞系BRL細胞培養(yǎng)，篩選有效HO-1 siRNA。用LPS、LPS+HO-1 siRNA、HO-1 siRNA和PBS溶劑分別處理大鼠肝細胞。用臺盼藍拒染實驗檢測細胞活力，Hoechst 33258熒光染色檢測細胞凋亡，Western印跡法檢測GRP78、CHOP、caspase-12以及HO-1蛋白表達。結果LPS能劑量依賴和時間依賴性誘導大鼠肝細胞HO-1蛋白表達上調(diào)，引起GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表達增高，細胞活力降低和細胞凋亡率增高；HO-1 siRNA預處理明顯抑制LPS對HO-1蛋白表達上調(diào)的誘導作用，并加劇LPS引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和細胞損傷。結論HO-1抑制LPS誘導大鼠肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的細胞損傷。

法醫(yī)病理學；RNA，小分子干擾；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；應激；脂多糖類；血紅素氧合酶-1；肝細胞；大鼠

在法醫(yī)學鑒定中，大面積軟組織挫壓傷引起外傷性多器官功能障礙綜合征（traumatic multiple organ dysfunction，T-MODS），進而導致死亡發(fā)生的案例時有發(fā)生。研究外傷引起器官實質(zhì)細胞損傷發(fā)生的分子機制有助于揭示外傷與死亡之間在病理學上的因果關系和判斷死亡性質(zhì)。研究[1]顯示，外傷應激能引起急性肝損傷，氧化應激可能是重要發(fā)生環(huán)節(jié)。持續(xù)而嚴重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起細胞死亡、誘導炎癥反應[2]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的細胞凋亡是脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起急性肝細胞損傷的重要發(fā)病途徑[3]。血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）是一種應激反應蛋白[4]，具有抗氧化損傷、抗凋亡和抗感染等細胞保護作用[5-7]，HO-1在MODS大鼠肝組織中表達上調(diào)[8]。本實驗采用HO-1小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）技術初步探討HO-1對LPS誘導培養(yǎng)的大鼠肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

大鼠正常肝細胞系BRL購自中國科學院上海細胞研究所細胞庫。LPS購自美國Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國HyClone公司；青霉素、鏈霉素、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒、Hoechst染色試劑盒購自上海碧云天生物公司；兔抗大鼠HO-1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；actin小鼠單克隆抗體購自美國Abmart公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG購自美國Fermentas Life Sciences公司；GRP78多克隆兔抗大鼠抗體、CHOP多克隆兔抗大鼠抗體和caspase-12多克隆兔抗大鼠抗體購自美國Santa Cruz公司；ECL化學發(fā)光顯色液購自美國Bio-Rad公司；siRNA轉染LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen公司。

3對HO-1 siRNA及對照siRNA序列由中國百奧邁科生物技術有限公司設計與合成，HO-1 siRNA-1上游引物5′-CAGAUCAGCACUAGUUCAU-3′，下游引物5′-AUGAACUAGUGCUGAUCUG-3′；HO-1 siRNA-2：上游引物5′-GGAACUUUCAGAAGGGUCA-3′，下游引物5′-UGACCCUUCUGAAAGUUCC-3′；HO-1 siRNA-3：上游引物5′-GAUACUACCUCUGCAGAGA-3′，下游引物5′-UCUCUGCAGAGGUAGUAUC-3′；陰性對照：上游引物5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′，下游引物5′-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3′。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

3110型細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；基礎型穩(wěn)壓電泳儀、Mini-PROTEAN4型垂直電泳槽、Tras-Blot SD半干轉印槽、ChemiDoc XRS型凝膠電化學發(fā)光成像系統(tǒng)、Image Lab圖像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；Countess全自動細胞計數(shù)儀購自美國Invitrogen公司；Microfuge 22R臺式冷凍離心機購自美國Beckman公司；BX51型倒置熒光顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組處理

BRL細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中用RPMI 1640完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、青霉素100U/mL、鏈霉素100U/mL）培養(yǎng)，每2d傳代一次。細胞貼壁覆蓋70%～80%時進行實驗。

為了檢測LPS誘導HO-1蛋白表達的量效和時效關系，分別用0.1、1、10、100mg/L LPS溶液處理細胞12h及10mg/L LPS處理細胞4、8、12、24h，LPS用PBS溶解，以PBS溶劑作為對照，在量效實驗中用0mg/mol表示，在時效實驗中用0h表示。為了檢測HO-1的作用，首先篩選有效的HO-1 siRNA序列，分為HO-1 siRNA組、HO-1 siRNA+LPS組、LPS組、PBS溶劑對照組。HO-1 siRNA+LPS組中HO-1 siRNA預處理24h，再給予10mg/L LPS繼續(xù)處理細胞12h。每組3復孔。

1.3 Western印跡法檢測蛋白表達

將對數(shù)生長期的BRL細胞接種于6孔板，根據(jù)實驗要求處理細胞，用PBS溶液洗滌，RIPA裂解液（200 μL/孔，每100 μL含1 μL蛋白酶抑制劑PMSF）充分裂解細胞，將混合物收集至微量離心管，4℃，21920×g離心15min，上清液即為總蛋白。用BCA法進行蛋白定量。各組取30μg樣品蛋白與相應體積的上樣緩沖液混勻，煮沸變性，經(jīng)12%Tris-甘氨酸十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用半干式電轉移（Tras-Blot SD半干轉印槽）至PVDF膜，用5%脫脂奶粉-TBST液室溫封閉PVDF膜2h，分別加入HO-1抗體（1∶100）、GRP78抗體（1∶200）、CHOP抗體（1∶200）和caspase-12抗體（1∶200），4℃孵育過夜，TBST振蕩洗膜后，加入1∶5 000稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL化學發(fā)光法顯色。同時以actin作為內(nèi)參照。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖片，Image Lab圖像分析系統(tǒng)進行分析，以目的蛋白與內(nèi)參的光密度比值作為蛋白的相對表達量。

1.4 臺盼藍拒染實驗檢測細胞活力

取對數(shù)生長期BRL細胞接種于6孔板，經(jīng)過相應處理后，胰酶消化制備成單細胞懸液。10μL懸液與0.4%臺盼藍染液1∶1混合均勻，將10μL混合液加入計數(shù)玻片，插入全自動細胞計數(shù)儀，調(diào)焦至最清晰，記錄活細胞數(shù)、死細胞數(shù)和細胞活力。細胞活力用百分比表示。

1.5 Hoechst 33258熒光染色法觀察細胞凋亡

取對數(shù)生長期的BRL細胞接種于12孔板，根據(jù)實驗要求處理細胞，PBS溶液洗滌細胞，用4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min，4℃、避光條件下，5 mg/L Hoechst 33258染色液作用15 min，在倒置熒光顯微鏡藍光下觀察、攝片。正常細胞核呈彌漫均勻的低強度熒光，凋亡細胞核呈濃染致密固縮狀態(tài)或顆粒狀熒光。隨機選取視野在熒光顯微鏡下攝片。然后，隨機選取相同大小的視野，根據(jù)細胞形態(tài)及熒光強度，統(tǒng)計凋亡細胞，計算細胞凋亡率。

1.6 HO-1 siRNA干擾

轉染前一天將對數(shù)生長期細胞接種于6孔板中培養(yǎng)，細胞匯合度達到30%～50%時進行轉染。為了篩選特異性高的HO-1 siRNA，先將稀釋好的3對HO-1 siRNA、陰性對照siRNA和稀釋好的轉染載體LipofectamineTM2000分別在室溫孵育5 min，再將轉

染載體與前二者分別混合，室溫孵育20 min，以便siRNA-LipofectamineTM2000復合物形成。將準備進行干擾的細胞取出，置于RPMI 1640培養(yǎng)液中，然后加入siRNA-LipofectamineTM2000復合物，4～6 h后，換完全培養(yǎng)液，繼續(xù)干擾至24h。然后進行染色并檢測HO-1蛋白表達量的變化。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 LPS誘導大鼠肝細胞HO-1表達上調(diào)

PBS溶劑處理的大鼠肝細胞存在低水平HO-1蛋白表達。與PBS溶劑處理比較，用0.1、1、10、100mg/L LPS處理12h，大鼠肝細胞HO-1表達呈劑量依賴性上調(diào)（P<0.05）；10 mg/L LPS處理4、8、12、24 h，大鼠肝細胞HO-1表達呈時間依賴性上調(diào)（P<0.05，表1～2）。

2.2 LPS誘導大鼠肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和細胞損傷

本實驗結果顯示，與對照組比較，10mg/L LPS引起大鼠肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志蛋白GRP78和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導細胞凋亡標志性蛋白CHOP和caspase-12表達明顯上調(diào)（表3）。

與對照組比較，10 mg/L LPS引起大鼠肝細胞細胞活力明顯降低（P<0.05），且細胞凋亡率明顯增高（P<0.05，圖1，表4）。

表1 不同質(zhì)量濃度LPS處理12h大鼠肝細胞HO-1的表達變化（n=3，）

表1 不同質(zhì)量濃度LPS處理12h大鼠肝細胞HO-1的表達變化（n=3，）

注：1）與對照組比較，P<0.05

LPS質(zhì)量濃度/（mg/L）HO-1相對表達強度0（溶劑對照）0.208±0.018 0.10.218±0.019 1.00.264±0.0181）100.312±0.0211）1000.308±0.0201）

表2 10mg/L LPS處理不同時間大鼠肝細胞HO-1的表達變化（n=3，）

表2 10mg/L LPS處理不同時間大鼠肝細胞HO-1的表達變化（n=3，）

注：1）與對照組比較，P<0.05

LPS處理時間/hHO-1相對表達強度0（溶劑對照）0.204±0.013 4 0.212±0.014 8 0.252±0.0191）120.310±0.0201）240.324±0.0211）

表3 HO-1 siRNA對LPS誘導大鼠肝細胞HO-1、GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表達的影響（n=3，）

表3 HO-1 siRNA對LPS誘導大鼠肝細胞HO-1、GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表達的影響（n=3，）

注：1）與溶劑對照組比較，P<0.05；2）與LPS組比較，P<0.05

組別HO-1GRP78CHOPcaspase-12溶劑對照0.222±0.0190.217±0.0180.237±0.0200.219±0.017 LPS0.318±0.0231）0.324±0.0191）0.346±0.0211）0.363±0.0211）HO-1 siRNA+LPS0.096±0.0141）0.373±0.0212）0.395±0.0212）0.412±0.0212）HO-1 siRNA0.072±0.0111）0.225±0.0180.242±0.0190.230±0.016

圖1 HO-1 siRNA對LPS誘導大鼠肝細胞凋亡的影響免疫熒光染色×200

表4 HO-1 siRNA對LPS誘導12h后大鼠肝細胞活力及凋亡率的影響（n=3，，%）

表4 HO-1 siRNA對LPS誘導12h后大鼠肝細胞活力及凋亡率的影響（n=3，，%）

注：1）與對照組比較，P<0.05；2）與LPS組比較，P<0.05

組別細胞活力凋亡率溶劑對照98.46±4.271.85±0.84 LPS62.37±2.941）34.42±2.321）HO-1 siRNA+LPS55.42±2.532）40.27±2.302）HO-1 siRNA95.23±3.822.09±0.54

2.3 HO-1 siRNA明顯抑制LPS引起大鼠肝細胞HO-1表達上調(diào)

為了篩選特異性高的HO-1 siRNA，實驗先用3對HO-1 siRNA分別預處理靜息的大鼠肝細胞24h，然后檢測HO-1蛋白表達量的變化。結果顯示，HO-1 siRNA-2明顯抑制HO-1蛋白表達，與轉染載體比較，HO-1蛋白表達下調(diào)了75%（圖2），陰性對照siRNA與轉染載體比較HO-1蛋白表達變化不大。故選擇

HO-1 siRNA-2進行后續(xù)實驗。

圖2 3對HO-1 siRNA特異性序列篩選的電泳圖

用HO-1 siRNA-2預處理細胞24 h后，加入10 mg/L LPS繼續(xù)處理細胞12 h，然后檢測HO-1蛋白表達量。結果顯示，HO-1 siRNA明顯抑制LPS引起的大鼠肝細胞HO-1表達上調(diào)（P<0.05，表3）。

2.4 HO-1 siRNA加劇LPS誘導大鼠肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和細胞損傷

HO-1 siRNA預處理24h后，LPS引起大鼠肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志性蛋白GRP78和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導細胞凋亡標志性蛋白CHOP和caspase-12蛋白表達均進一步明顯上調(diào)，明顯高于單獨LPS作用的效應（P< 0.05，表3）。與LPS單獨作用比較，HO-1 siRNA+LPS處理的大鼠肝細胞細胞活力進一步降低（P<0.05）、細胞凋亡率增高（P<0.05），而單獨HO-1 siRNA處理對大鼠肝細胞細胞活力、細胞凋亡率無明顯影響（表4）。

3 討論

T-MODS是機械性損傷引起機體死亡發(fā)生的并發(fā)癥之一。T-MODS死亡案件的特點有：外傷（特別是大面積軟組織外傷）未直接傷及機體重要器官，外傷程度貌似輕微，外傷后遷延一段時間死亡才發(fā)生，期間往往接受了臨床治療，或因外傷后免疫功能降低、繼發(fā)了感染等多種介入因素，這導致判斷死因、死亡方式乃至案件性質(zhì)出現(xiàn)困境。判斷T-MODS致死的前提條件在于，評估外傷激活或誘導受傷機體發(fā)生異常的病理過程（如過度的炎癥反應）是死亡發(fā)生的主要因素，應指出這些機體異常的病理過程往往是非特異性的。因此，探索生命重要器官損傷和實質(zhì)細胞損傷乃至細胞死亡發(fā)生機制，對評估和判斷機體死亡性質(zhì)具有積極意義。研究[3]表明，LPS能夠劑量和時間依賴性地誘導大鼠肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的肝細胞損傷。本實驗發(fā)現(xiàn)，LPS在通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導細胞凋亡途徑引起大鼠肝細胞損傷的同時，還能誘導大鼠肝細胞HO-1蛋白表達上調(diào)，而HO-1表達上調(diào)具有抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的大鼠肝細胞凋亡、發(fā)揮細胞保護作用。

HO-1是相對分子質(zhì)量為32000的應激蛋白，在氧氣和NADPH存在的條件下，HO-1降解血紅素，生成等摩爾的膽綠素、游離鐵和一氧化碳（CO），其中CO和膽綠素的衍生物膽紅素具有抗氧化效應，而游離鐵能通過Fenton反應生成氧化能力更強的羥自由基，加劇氧化損傷。新近研究[9]顯示，細胞鐵代謝或鐵穩(wěn)態(tài)異?？赡苁羌毎劳龅年P鍵環(huán)節(jié)。Liu等[10]報道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導劑能激活抗氧化元件，引起培養(yǎng)的血管平滑肌細胞HO-1表達上調(diào)，HO-1表達通過CO而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的血管平滑肌細胞凋亡。Kim等[11]報道HO-1的催化產(chǎn)物之一CO能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激下游PERK通路激活轉錄因子Nrf 2，進而誘導血管內(nèi)皮細胞HO-1表達增加。Chung等[12]也報道，外源性CO能將增強培養(yǎng)的肝細胞肝癌細胞系HepG2細胞PERK，減輕IRE1和ATF6通路，僅僅PERK途徑參與介導CO對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導劑引起C反應蛋白表達的抑制作用。Lin等[13]報道脂質(zhì)過氧化損傷產(chǎn)物4-HNE能激活HepG2細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激下游的PERK、IRE1和ATF6通路并引起HO-1表達增加。同樣在HepG2細胞，葡萄糖剝奪能夠引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激但HO-1表達無明顯變化[14]，而無氧酵解產(chǎn)物琥珀酸可能是缺血再灌注損傷的關鍵物質(zhì)。在培養(yǎng)的人纖維肉瘤細胞系HT1080細胞，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激源性活性氧參與介導HO-1蛋白表達[15]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激下游的非折疊蛋白反應信號途徑介導了HO-1蛋白表達上調(diào)[10-13]，并且細胞類型不同，非折疊蛋白反應的不同信號途徑有別。也有報道[14]內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激下游信號不參與引起HO-1表達。本實驗發(fā)現(xiàn)，LPS在啟動大鼠肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的細胞凋亡的同時也能誘導HO-1表達上調(diào)，后者發(fā)揮細胞保護的作用。HO-1抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的機制可能有：HO-1本身是分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應激蛋白，具有GRP78等分子伴侶的功能，有助于促進錯誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)恢復正常的構象；HO-1具有抗氧化能力，能調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化還原穩(wěn)態(tài)，營造適合新合成蛋白質(zhì)分子折疊的氧化還原微環(huán)境；HO-1可能通過偶聯(lián)線粒體生物合成、減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的細胞死亡[16]，通過增強自噬而抑制性調(diào)節(jié)細胞死亡[17]。以往實驗[18]發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑和ROS清除劑NAC減輕了LPS引起的大鼠肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，ROS可能參與介導HO-1蛋白表達上調(diào)。最近還發(fā)現(xiàn)，LPS能劑量依賴性地誘導大鼠肝細胞產(chǎn)生氣體信使分子硫化氫增多，外源性硫化氫預適應或后適應均能顯著上調(diào)LPS誘導的大鼠肝細胞HO-1蛋白表達[19]，硫化氫預適應能減輕而其后處理則加劇LPS引起的大鼠肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[20-21]，這些實驗結果提示，大鼠肝細胞HO-1表達上調(diào)很可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的上游事件。值得指出，HO-1屬于誘導蛋白，HO-1催化產(chǎn)物CO能誘導血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞HO-1蛋白表達[10-11]，

在大鼠肝細胞，肝細胞內(nèi)源性CO是否是介導HO-1蛋白上調(diào)、拮抗LPS所致大鼠肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的關鍵分子尚有待進一步研究。

總之，本實驗結果顯示，抗氧化蛋白HO-1表達上調(diào)是減輕LPS引起大鼠肝細胞損傷的重要因素。這一細胞水平的實驗結果提示，大鼠肝細胞對外界致傷因素的反應是不均衡的，致傷因素引起包括HO-1在內(nèi)的內(nèi)源性代償機制破壞，由代償轉變?yōu)槭Т鷥敳拍軐е抡w細胞死亡發(fā)生，這或許適用于外傷引起的T-MODS，繼而引起機體死亡。

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Effects of HO-1 on Lipopolysaccharide-induced Endoplasmic Reticulum Stress of Rat Hepatocytes

WANG Yan-sha,JI Ying-lei,WANG Tao,WU Lin-lin,FEI Cheng-ping,LIU Yi-chang,GU Zhen-yong
（Department of Forensic Medicine,Medical College of Nantong University,Nantong 226001,China）

Objective To investigate effects of antioxidant stress protein heme oxygenase-1（HO-1）on lipopolysaccharide（LPS）-induced endoplasmic reticulum stress（ERS）of rat hepatocytes.Methods The BRL cells（rat hepatocyte cell line）were cultured.The hepatocytes were treated with LPS,LPS+HO-1 siRNA,HO-1 siRNA and PBS solution,respectively.The cell viability was measured by trypan blue exclusion test.The apoptosis cells were detected by the fluorescent dye Hoechst 33258.Expressions of GRP78,CHOP,caspase-12 and HO-1 were detected by Western blotting.Results LPS caused an increase of HO-1 protein expression of rat hepatocytes in a dose-dependent and time-dependent manner, a up-regulation of GRP78,CHOP and caspase-12,a decrease in cell viability,and an increase in apoptosis rate of hepatocytes.Pretreatment of HO-1 siRNA inhibited the up-regulation of LPS-induced HO-1, however,aggravated ERS and cellular injury.Conclusion HO-1 inhibites ERS-mediated cellular injury of rat hepatocytes induced by LPS.

forensic pathology;RNA,small interfering;endoplasmic reticulum;stress;lipopolysaccharides;heme oxygenase-1;hepatocytes;rats

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.06.001

1004-5619（2015）06-0417-05

2014-12-22）

（本文編輯：劉寧國）

國家自然科學基金資助項目（81273341）；江蘇省高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目（PAPD）

王艷莎（1987—），女，碩士，主要從事法醫(yī)病理學研究

谷振勇，男，博士，教授，主要從事創(chuàng)傷性MODS、血管生物學和呼吸肌疲勞信號轉導機制研究；E-mail：zygusz@126.com