王艷，王茜，陳國平，范紅石

夾脊電針和神經(jīng)松動術(shù)對兔坐骨神經(jīng)損傷后軸突再生和血清神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響①

王艷1，王茜2，陳國平1，范紅石2

目的觀察夾脊電針和神經(jīng)松動術(shù)對兔坐骨神經(jīng)損傷后軸突再生和血清腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)含量的影響。方法30只成年雄性兔分為模型組(n=6)、假手術(shù)組(n=6)、神經(jīng)松動術(shù)組(n=6)、夾脊電針組(n=6)、夾脊電針結(jié)合神經(jīng)松動術(shù)組(n=6)。鉗夾法復(fù)制坐骨神經(jīng)損傷模型。模型組、假手術(shù)組不做任何干預(yù)，神經(jīng)松動術(shù)組行神經(jīng)松動術(shù)治療，夾脊電針組進行夾脊電針治療，夾電針結(jié)合神經(jīng)松動術(shù)組進行夾脊電針和神經(jīng)松動術(shù)治療。治療4周后，HE染色觀察軸突生長情況，ELISA法檢測血清BDNF、CNTF含量。結(jié)果神經(jīng)松動術(shù)組、夾脊電針組、夾脊電針結(jié)合神經(jīng)松動術(shù)組軸突生長情況均優(yōu)于模型組，夾脊電針結(jié)合神經(jīng)松動術(shù)組優(yōu)于神經(jīng)松動術(shù)組和夾脊電針組；神經(jīng)松動術(shù)組、夾脊電針組、夾脊電針結(jié)合神經(jīng)松動術(shù)組血清BDNF、CNTF含量均高于模型組(P＜0.05)，夾脊電針結(jié)合神經(jīng)松動術(shù)組優(yōu)于神經(jīng)松動術(shù)組和夾脊電針組(P＜0.05)。結(jié)論神經(jīng)松動術(shù)、夾脊電針均可促進兔損傷坐骨神經(jīng)的軸突再生，可能與提高血清中CNTF、BDNF水平有關(guān)；兩者結(jié)合效果更佳。

周圍神經(jīng)損傷；坐骨神經(jīng)；夾脊電針；神經(jīng)松動術(shù)；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子；軸突再生；兔

[本文著錄格式]王艷，王茜，陳國平，等.夾脊電針和神經(jīng)松動術(shù)對兔坐骨神經(jīng)損傷后軸突再生和血清神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐,2015,21(4):417-421.

CITED AS:Wang Y,Wang Q,Chen GP,et al.Effects of Jiaji electroacupuncture and neurodynamic mobilization technique on axon regeneration and content of neurotrophic factors in rabbits with sciatic nerve injury[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(4): 417-421.

周圍神經(jīng)損傷常常導(dǎo)致部分或全部的運動、感覺以及自主神經(jīng)功能喪失，這是由于周圍神經(jīng)軸索中斷，遠端發(fā)生Wallerian變性[1]。周圍神經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system,PNS)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)在功能上緊密聯(lián)系，周圍神經(jīng)損傷后，損傷神經(jīng)的胞體、突起和相應(yīng)的中樞神經(jīng)細胞都會發(fā)生改變[2]。本研究用夾脊電針和神經(jīng)松動術(shù)對兔坐骨神經(jīng)損傷進行干預(yù)，觀察其對軸突和胞體，以及血清中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

日本大耳白兔，雄性，4～5月齡，體重1.5～2.0 kg，哈爾濱派斯菲科生物制藥股份有限公司提供，許可證號：SCXK(黑)2011-009。適應(yīng)性喂養(yǎng)后進入實驗。動物飼養(yǎng)和取材均遵守實驗動物管理和保護的有關(guān)規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1 模型制備

兔禁食水12 h后，10%水合氯醛1～2 ml/kg耳緣靜脈注射麻醉。角膜反射消失后，俯臥位固定于動物手術(shù)臺上。左側(cè)大腿外側(cè)剃毛，碘伏術(shù)區(qū)皮膚消毒。于股骨前緣中段凹陷處，延凹陷并平行于股骨干做縱形切口約2 cm。鈍性分離股二頭肌和股直肌，游離坐骨神經(jīng)，用改良后的止血鉗三扣垂直于股骨中點鉗夾坐骨神經(jīng)5 min，鉗夾處肉眼可觀察到神經(jīng)被夾處神經(jīng)纖維斷裂，神經(jīng)扁平且透明。之后常規(guī)分層縫合筋膜、皮膚。假手術(shù)組游離坐骨神經(jīng)后不鉗夾，逐層縫合傷口。術(shù)后予青霉素4×105U注射，每天2次，共3 d。分籠飼養(yǎng)。

造模成功標(biāo)準(zhǔn)：行為學(xué)觀察，家兔活動量減少，左后肢動作減少，出現(xiàn)足背拖地現(xiàn)象，足尖上抬無力，下垂現(xiàn)象明顯，身體重心明顯右移，前行主要靠臀部肌肉收縮。

1.2.2 分組和干預(yù)

剔除麻醉和手術(shù)意外死亡的動物，將符合標(biāo)準(zhǔn)的30只兔分為5組：模型組、假手術(shù)組、神經(jīng)松動術(shù)組、夾脊電針組、夾脊電針結(jié)合神經(jīng)松動術(shù)組，每組6只。

模型組、假手術(shù)組不做任何干預(yù)，只予其他組同等條件抓取。

神經(jīng)松動術(shù)組術(shù)后第3天將兔取仰臥位固定于實驗臺上，使左下肢懸空于臺外。按限制條件的要求擺好準(zhǔn)備姿勢，將髖關(guān)節(jié)固定為外展45°，股骨與脛骨夾角30°。沿著坐骨神經(jīng)走向，迅速將膝關(guān)節(jié)伸展至130°，之后放松還原至預(yù)備姿勢。每次操作時間1 s，放松5 s，每組10次，每天1組，每周治療6 d，共4周，由同一人操作[3]。

夾脊電針組術(shù)后第3天將兔取俯臥位固定于實驗臺上，于兔L5～L7棘突旁雙側(cè)取穴，1寸針灸針直刺，深度約0.5 cm，接KWD-808I脈沖針灸治療儀(常州英迪電子醫(yī)療器械有限公司)，疏密波，電流強度以家兔背部針顫動為準(zhǔn)，每次30 min，每天1次，每周6 d，共4周。

夾脊電針結(jié)合神經(jīng)松動術(shù)組每日先進行夾脊電針治療，后進行神經(jīng)松動術(shù)治療，方法同上。共4周。

1.3 檢測指標(biāo)

干預(yù)4周后，各組兔10%水合氯醛1～2 ml/kg耳緣靜脈注射麻醉，沿造模時切口，重新游離坐骨神經(jīng)。手術(shù)線標(biāo)記受損神經(jīng)遠側(cè)端，以神經(jīng)鉗夾傷處為中點，剪取坐骨神經(jīng)約2 cm。多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋。再將兔取仰臥位固定于動物手術(shù)臺上，在心搏最明顯處穿刺，經(jīng)心臟取血5 ml，3000 r/ min離心5 min，取血清，-20℃冰箱保存待測。

1.3.1 HE染色

石蠟切片脫蠟至水，入蘇木素(H)染液5 min，70%鹽酸酒精分化10 s，自來水充分沖洗，使細胞核藍化，蒸餾水洗；入伊紅(E)染液1 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹脂封片。應(yīng)用OLYMPUS DP72顯微攝像系統(tǒng)400倍下觀察軸突再生情況，并攝片。

1.3.2 ELISA法檢測血清BDNF、CNTF含量

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋，加樣，溫育，配液，洗滌，加酶，溫育，洗滌，顯色，終止，試劑盒(上海通蔚實業(yè)有限公司)測定。測定在加終止液后15 min內(nèi)進行。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品光密度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HE染色

假手術(shù)組坐骨神經(jīng)由大小不等的神經(jīng)束組成，外面被神經(jīng)束膜和外膜包繞，神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)完整，分布均勻，軸突直徑比較一致，排列規(guī)則。

模型組組織結(jié)構(gòu)排列疏松，大部分纖維潰變，部分神經(jīng)纖維固縮；神經(jīng)再生纖維稀少、分散，再生軸突不明顯，且排列紊亂，少量再生髓鞘薄，間質(zhì)明顯增多；神經(jīng)組織粗細不一，空泡樣改變明顯，神經(jīng)細胞核消失明顯；可見炎性細胞小灶性浸潤。

夾脊電針結(jié)合神經(jīng)松動術(shù)組、夾脊電針組、神經(jīng)松動術(shù)組神經(jīng)再生纖維數(shù)目多，分布較均勻，髓鞘完整、規(guī)則，軸突生長良好，可見許多新生纖維斷面；施萬細胞增生活躍，空泡樣改變和神經(jīng)細胞核消失較少；見散在炎性細胞浸潤；神經(jīng)干和外膜有再生血管分布，束間結(jié)締組織較少。且夾脊電針結(jié)合神經(jīng)松動術(shù)組軸突生長情況優(yōu)于其他兩組。見圖1。

2.2 血清CNTF、BDNF

血清CNTF、BDNF水平，各模型組與假手術(shù)組比較均有顯著性差異(P＜0.05)；夾脊電針結(jié)合神經(jīng)松動術(shù)組、夾脊電針組、神經(jīng)松動術(shù)組均優(yōu)于模型組(P＜0.05)；夾脊電針結(jié)合神經(jīng)松動術(shù)組優(yōu)于夾脊電針組、神經(jīng)松動術(shù)組(P＜0.05)；夾脊電針組與神經(jīng)松動術(shù)組之間無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組干預(yù)后血清CNTF、BDNF水平比較(μg/L)

圖1 干預(yù)后各組坐骨神經(jīng)(HE染色，400×)

3 討論

周圍神經(jīng)損傷后，損傷神經(jīng)的神經(jīng)胞體和突起都會發(fā)生變性。神經(jīng)元失去靶細胞產(chǎn)生的逆行運輸?shù)纳窠?jīng)營養(yǎng)物質(zhì)[4]，神經(jīng)元內(nèi)染色體常常溶解、樹突回縮[1]，損傷軸突遠端發(fā)生Wallerian變性等。有研究顯示，成年人前根離斷會造成50%～80%脊髓前角細胞在幾周內(nèi)退變甚至死亡[5-6]。

BDNF及其受體trkB對維持神經(jīng)再生至關(guān)重要[7]；剝奪了內(nèi)源性BDNF會破壞軸突生長和髓鞘再生[8]。外源性BDNF能夠促進大鼠周圍神經(jīng)髓鞘的生長，而去除BDNF則髓鞘的生長受到抑制[9-10]。

CNTF也發(fā)揮對神經(jīng)細胞的營養(yǎng)作用[11]。1976年，CNTF于雞胚眼組織睫狀神經(jīng)節(jié)中發(fā)現(xiàn)，因其對睫狀神經(jīng)元有營養(yǎng)作用而得名，它是目前發(fā)現(xiàn)的唯一具有神經(jīng)營養(yǎng)和肌肉營養(yǎng)雙重作用的因子[12-13]。神經(jīng)損傷后，軸突遠端CNTF mRNA水平迅速下降，軸突再生時逐漸恢復(fù)。CNTF能夠促進感覺神經(jīng)元和交感神經(jīng)元生長，防止體內(nèi)脊髓運動神經(jīng)元凋亡。在神經(jīng)損傷后，局部和全身應(yīng)用CNTF 4～6周，可觀察到損傷遠端再生軸突數(shù)量顯著增加，形成的髓鞘數(shù)量也更多[14]。由于CNTF對治療周圍神經(jīng)損傷有重要價值，人們用各種方法制備提取CNTF，應(yīng)用于人運動神經(jīng)元疾病的治療，但療效不滿意[15]。

在生理狀態(tài)下，周圍神經(jīng)的施萬細胞中存在大量CNTF，脊髓前角運動神經(jīng)元胞體和骨骼肌細胞中也有較高水平的CNTF表達。周圍神經(jīng)損傷后，CNTF大量釋放到細胞外間隙；此時完整的施萬細胞中并無CNTF，當(dāng)發(fā)生Wallerian變性脫髓鞘時，CNTF表達降低；神經(jīng)再生軸突再髓鞘化時，CNTF表達恢復(fù)正常。同時，失神經(jīng)支配的骨骼肌細胞CNTF受體mRNA表達急劇升高[16]。

夾脊穴是臨床常用的經(jīng)外奇穴，治療范圍廣泛且療效確切。其中腰部穴位治療腰腹和下肢疾病[17]。電針輸出波形選用疏密波，克服單一波形產(chǎn)生適應(yīng)的缺點；電刺激加強局部代謝，促進胞漿流運輸，改善神經(jīng)根周圍組織營養(yǎng)。

周圍神經(jīng)損傷后，神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵在于受損神經(jīng)元是否存活，數(shù)量和功能，以及軸索能否成功再生，由此可見保護神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的重要性[18]。夾脊電針可抗內(nèi)生性損傷電流，阻止Ca2+內(nèi)流，穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)，增加線粒體酶活性，阻斷神經(jīng)元繼發(fā)性病變，保護脊神經(jīng)軸突的退變，促進神經(jīng)軸突再生[19]。李曉寧等的研究發(fā)現(xiàn)，夾脊電針能提高BDNF、BDNF mRNA、神經(jīng)生長因子、Bcl-2、Bcl-2 mRNA在脊髓損傷中的陽性表達，抑制脊髓損傷早期細胞凋亡[20]。本研究顯示，夾脊電針對損傷的周圍神經(jīng)神經(jīng)再生發(fā)揮著積極作用。

神經(jīng)松動技術(shù)根據(jù)神經(jīng)特殊的解剖結(jié)構(gòu)，通過肢體運動，使神經(jīng)組織在神經(jīng)外周的軟組織中進行滑動、加壓、延展、張力變化等，從而改善神經(jīng)微循環(huán)、軸向傳輸和脈沖頻率。

神經(jīng)松動術(shù)可降低神經(jīng)張力，減少粘連，改善神經(jīng)血液循環(huán)，恢復(fù)神經(jīng)正常功能。周圍神經(jīng)主要由神經(jīng)纖維、結(jié)締組織以及血管組成，周圍神經(jīng)血管在神經(jīng)外膜、神經(jīng)內(nèi)膜縱向走行，神經(jīng)束膜斜向走形，血管之間相互吻合[21]。神經(jīng)松動術(shù)拉長神經(jīng)，血液從大血管流到神經(jīng)外膜、神經(jīng)束膜和神經(jīng)內(nèi)膜，最后到達神經(jīng)纖維，促進血液循環(huán)，改善神經(jīng)張力，恢復(fù)神經(jīng)的正常位置，減少神經(jīng)粘連，促進軸漿運輸，利于有害物質(zhì)的排出，營養(yǎng)物質(zhì)的輸送，使其恢復(fù)正常生理功能[22-27]。神經(jīng)松動術(shù)臨床上主要用于周圍神經(jīng)卡壓傷引起的神經(jīng)源性疼痛。用于臂叢神經(jīng)損傷的治療也療效明顯[28]。本研究顯示，能夠促進損傷的周圍神經(jīng)再生。

本研究還顯示，夾脊電針對和神經(jīng)松動術(shù)同時干預(yù)，效應(yīng)增強，能達到事半功倍的效果。

綜上所述，神經(jīng)松動術(shù)、夾脊電針均可促進損傷神經(jīng)的軸突再生，可能與提高血清CNTF、BDNF水平有關(guān)；聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。具體機制有待于進一步研究。

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Effects of Jiaji Electroacupuncture and Neurodynamic Mobilization Technique on Axon Regeneration and Content of Neurotrophic Factors in Rabbits with Sciatic Nerve Injury

WANG Yan1,WANG Qian2,CHEN Guo-ping1,FAN Hong-shi1
1.The Second Hospital of Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150001, China;2.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150040,China

Objective To observe the effects of Jiaji electroacupuncture and neurodynamic mobilization technique on axon regeneration and content of brain-derived neurotrophic factor(BDNF)and ciliary neurotrophic factor(CNTF)in rabbits with sciatic nerve injury.Methods 30 male adult rabbits were assigned to sham(A,n=6),model(B,n=6),neurodynamic mobilization(C,n=6),Jiaji electroacupuncture (D,n=6),and Jiaji electroacupuncture combine with neurodynamic mobilization(E,n=6)groups.The group C was treated with neurodynamic mobilization,the group D with Jiaji electroacupuncture,and the group D with both 3 days after modeling of clamping at sciatic nerve, while the groups A and B with no treatment.The axon regeneration was observed with HE staining,and the content of BDNF and CNTF in serum was measured with ELISA 4 weeks after treatment.Results The axons regeneration was observed better in the groups C,D and E than in the group B.The content of BDNF and CNTF was more in the groups C,D and E than in the group B(P＜0.05).Conclusion Both Jiaji electroacupuncture and neurodynamic mobilization can improve axon regeneration with synergistic action,which may associate with the increase of BDNF and CNTF in serum.

peripheral never injury;sciatic nerve;Jiaji electroacupuncture;neurodynamic mobilization technique;brain-derived neurotrophic factor;ciliary neurotrophic factor;axon regeneration;rabbits

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.04.011

R745.4

A

1006-9771(2015)04-0417-05

2014-08-19

2014-11-03)

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新人才基金項目(No.051290)；2.黑龍江省博士后基金項目(No.LBH-Z13202)。

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱市150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱市150040。作者簡介：王艷(1967-)，女，遼寧莊河縣人，博士，博士后，主任醫(yī)師，教授，主要研究方向：周圍神經(jīng)損傷康復(fù)。