仲 飛，童鑄廷，范璐璐，姚夢(mèng)群，孫國(guó)平

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽合肥 230022)

小分子RNA(microRNA，miRNA)是一類廣泛存在于動(dòng)物和植物等多細(xì)胞生物中約22個(gè)核苷酸左右的非編碼單鏈小分子RNA，它們通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默，在生物許多重要的功能基因網(wǎng)絡(luò)中起著重要調(diào)控的作用［1］。沒藥為印度傳統(tǒng)草藥，數(shù)千年來被用作香料、食品、化妝品和藥品［2］?，F(xiàn)代研究表明，沒藥甾酮(Guggulsterone)是沒藥中主要生物活性成分之一，具有多種藥理活性，如抗炎、抗氧化、降血脂、抗腫瘤、改善認(rèn)知行為等［3］。但沒藥甾酮抗腫瘤機(jī)制是否涉及miRNA尚無報(bào)道，本研究觀察了沒藥甾酮對(duì)膽管癌RBE細(xì)胞株移植瘤生長(zhǎng)的影響，同時(shí)利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)沒藥甾酮對(duì)移植瘤miRNA表達(dá)譜的影響，篩選得到差異表達(dá)的miRNAs，深化了對(duì)沒藥甾酮抗腫瘤機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 21只6～7周齡健康雌性SD大鼠，質(zhì)量150～170 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SYXK(皖)2005－02。飼養(yǎng)于SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。人膽管癌RBE細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。沒藥甾酮為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，GeneChip?miRNA芯片及試劑盒為美國(guó)Affymetrix公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與處理 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RBE細(xì)胞，PBS漂洗，RPMI1640培養(yǎng)基(不含血清)重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1 ×1010·L－1，每只 0.8 mL 右側(cè)后腿皮下注射，建立動(dòng)物移植瘤模型。移植后72 h后，動(dòng)物按完全隨機(jī)原則均分為3組:高劑量實(shí)驗(yàn)組、低劑量實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組。高、低劑量實(shí)驗(yàn)組大鼠分別予 40、20 mg·kg－1·d－1沒藥甾酮，灌胃給藥，對(duì)照組大鼠灌胃給予等量生理鹽水。每5 d測(cè)量裸鼠質(zhì)量和腫瘤體積，處理30 d后取材。

1.2.2 腫瘤體積檢測(cè) 游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)、短徑，計(jì)算腫瘤體積，公式:V(cm3)=長(zhǎng)徑×短徑2×0.5。

1.2.3 腫瘤組織總RNA的提取 高劑量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組每組取4只大鼠，每只鼠剪取腫瘤組織0.1 g，制備組織勻漿，進(jìn)行標(biāo)本混樣，Trizol試劑常規(guī)抽提總RNA。每個(gè)樣品取1 μL，雙蒸水稀釋200倍后用核酸蛋白定量?jī)x測(cè)定RNA含量與純度，要求總RNA樣品的OD 260/280＞1.8，OD 260/230＞1.5。

1.2.4 miRNAs表達(dá)譜的檢測(cè) 使用 60 ～100 μg總RNA，miRNA Isolation Kit分離 miRNA，使用 Poly(A)聚合酶加尾，T4 RNA連接酶將其與帶生物素標(biāo)記的信號(hào)分子連接、標(biāo)記，后將miRNA溶于含25%甲酰胺的100 μL 6 ×SSPE 緩沖液(0.90 mol·L－1NaCl，60 mmol·L－1Na2HPO4，6 mmol·L－1EDTA，pH 6.8)進(jìn)行雜交，于38℃與微陣列雜交過夜。雜交結(jié)束后，微陣列玻片于40℃下用2×SSC漂洗6 min，甩干后，GenePix 4000B雙通道激光掃描儀進(jìn)行掃描，采用 SignificanceAnalysisofMicroarrays(SAM，version 2.1)軟件分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)位點(diǎn)。表達(dá)譜檢測(cè)由杭州聯(lián)川生物科技有限公司完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。三組之間裸鼠質(zhì)量及腫瘤體積的不同時(shí)間點(diǎn)比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法，兩組miRNA芯片結(jié)果采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 沒藥甾酮對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用 各組大鼠飼養(yǎng)期間生長(zhǎng)狀態(tài)良好，移植瘤成瘤率100%，各組鼠間質(zhì)量差異無顯著性。沒藥甾酮高、低劑量實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積分別在處理20 d和25 d后顯著低于對(duì)照組，提示沒藥甾酮干預(yù)抑制了移植瘤生長(zhǎng);作用25 d和30 d后，高劑量組移植瘤體積顯著低于低劑量實(shí)驗(yàn)組，說明沒藥甾酮抑瘤作用呈劑量依賴性，見圖1。

2.2 沒藥甾酮對(duì)移植瘤miRNA表達(dá)譜的影響高劑量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組移植瘤組織進(jìn)行miRNAs表達(dá)譜的基因芯片檢測(cè)分析，結(jié)果表明兩組間表達(dá)水平具有顯著差異的miRNAs有18個(gè)，其中較對(duì)照組顯著上調(diào)的有11個(gè)，顯著下調(diào)的有7個(gè)。見表1。

表1 沒藥甾酮對(duì)移植瘤組織miRNAs表達(dá)的影響

3 討論

沒藥原產(chǎn)印度，為橄欖科植物沒藥樹樹干皮部滲出的油膠樹脂，作為藥用已有數(shù)千年歷史，很早就傳入我國(guó)，古代中醫(yī)典籍中對(duì)其多有記載。沒藥甾酮是沒藥中主要生物活性成分之一，具有多種藥理活性，近年來其抗腫瘤作用逐漸引起關(guān)注［4］。實(shí)驗(yàn)證明，沒藥甾酮對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制增殖、誘導(dǎo)分化或凋亡、降低侵襲轉(zhuǎn)移等作用，其抗腫瘤機(jī)制涉及多條細(xì)胞內(nèi)分子信號(hào)通路，包括:Nrf2，NF-kB，STAT3，和 AP-1，MAPKs，PI3K/Akt等［4－10］。但是，這些機(jī)制相對(duì)分散，不同研究者的結(jié)果難以互相印證，因而有必要更深入的研究其抗腫瘤的關(guān)鍵機(jī)制，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)及療效預(yù)測(cè)指標(biāo)，充分開發(fā)利用沒藥甾酮的抗腫瘤潛力。

研究表明，miRNA家族是基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因子，每個(gè)miRNA可能調(diào)控著數(shù)百個(gè)基因的表達(dá)，一個(gè)基因的表達(dá)又可能受多個(gè)miRNA的調(diào)控，提示miRNA可能以網(wǎng)絡(luò)的形式參與調(diào)控所有信號(hào)通路［1］，并有研究提示miRNA在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［11－13］。那么miRNA在沒藥甾酮的抗腫瘤作用中發(fā)揮怎樣的作用呢?

本實(shí)驗(yàn)首次報(bào)道了沒藥甾酮在體內(nèi)對(duì)膽管癌移植瘤有抑制作用，同時(shí)伴隨著miRNAs表達(dá)譜的改變，這提示沒藥甾酮可能通過調(diào)節(jié)miRNAs的表達(dá)進(jìn)而影響某些關(guān)鍵靶蛋白的活性從而起到抗瘤作用。我們初步分析了藥物處理前后腫瘤組織中表達(dá)水平具有顯著差異的18個(gè)miRNAs，發(fā)現(xiàn)其中某些miRNAs具有重要的生物學(xué)功能，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，例如:miRNA-21是一個(gè)明確的腫瘤相關(guān)基因［14］，其可以通過調(diào)節(jié)多條細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來影響腫瘤的生物學(xué)行為，沒藥甾酮完全可能通過下調(diào)miRNA-21來發(fā)揮抗腫瘤作用。進(jìn)一步的研究將采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)表達(dá)差異明顯的miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)合生物信息學(xué)與實(shí)驗(yàn)生物學(xué)方法對(duì)miRNAs可能在沒藥甾酮抗膽管癌中作用進(jìn)行深入探討。

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