王燕　江瑩　厲穎　周永春

(上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司　上海　201506)

無(wú)血清培養(yǎng)基的優(yōu)化對(duì)rhEPO-Fc融合蛋白體外活性的影響

王燕*江瑩厲穎周永春

(上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司上海201506)

目的：研究基礎(chǔ)培養(yǎng)基I/F/D中添加不同濃度的培養(yǎng)基組分對(duì)rhEPO-Fc融合蛋白體外活性的影響。方法：通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合Box-Behnken 效應(yīng)面法，篩選適合rhEPO-Fc表達(dá)的較優(yōu)培養(yǎng)基組分。結(jié)果：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加1% F68、10%維生素、7.7 g/L腐胺、10.1 g/L乙醇胺和5.38 g/L胰島素時(shí)，rhEPO-Fc融合蛋白的體外活性可達(dá)10 268 IU/ml，比初始的基礎(chǔ)培養(yǎng)基I/F/D提高了108.4%。結(jié)論：優(yōu)化后的培養(yǎng)基能提高rhEPO-Fc融合蛋白體外活性，降低生產(chǎn)成本，可為后期的中試生產(chǎn)提供重要參考。

無(wú)血清培養(yǎng)基腐胺乙醇胺胰島素

促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）是一種主要由腎臟分泌的調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的酸性糖蛋白激素[1]。它的主要作用在于與紅系祖細(xì)胞的表面受體結(jié)合，促進(jìn)紅系祖細(xì)胞增生與分化，促進(jìn)紅母細(xì)胞成熟，增多紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白含量，穩(wěn)定紅細(xì)胞膜，提高紅細(xì)胞膜抗氧化功能。臨床上主要用于心血管、腦神經(jīng)、腎臟和視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)及各種類型的貧血[2-3]。1985年EPO基因克隆和表達(dá)成功，使rhEPO大規(guī)模生產(chǎn)成為可能，但它在人體內(nèi)血清循環(huán)半衰期僅為4～8 h，臨床用藥過(guò)程中需要頻繁給藥，不僅給患者帶來(lái)痛苦，且易產(chǎn)生耐受性及各種不良反應(yīng)。IgG型的免疫球蛋白是人類血液中最豐富的蛋白質(zhì)，它們的半衰期可長(zhǎng)達(dá)21 d，目前已有報(bào)道將人IgG的Fc區(qū)域與其它蛋白質(zhì)融合可顯著延長(zhǎng)目的蛋白的半衰期，提高體內(nèi)生物活性[4]。

為此，我公司將rhEPO和人IgG的Fc區(qū)域進(jìn)行融合表達(dá)，使rhEPO-Fc融合蛋白保留了rhEPO生物活性又延長(zhǎng)了半衰期，更適合于臨床應(yīng)用。在研發(fā)的過(guò)程中，最初使用普通的基礎(chǔ)無(wú)血清培養(yǎng)基和商業(yè)化培養(yǎng)基CD CHO AGTTM（Gibco公司，CNY 900/L）分別來(lái)生產(chǎn)rhEPO-Fc融合蛋白，其體外活性分別為4 926 IU/ml和8 326 IU/ml。雖然商業(yè)化培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)rhEPO-Fc融合蛋白的體外活性較高，但該培養(yǎng)基價(jià)格昂貴，在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)時(shí)，會(huì)給整個(gè)生產(chǎn)成本帶來(lái)極大的壓力。本研究主要以IMDM、DMEM/F12（Gibco公司，CNY 100/L）培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)F68、維生素、腐胺、乙醇胺、胰島素等培養(yǎng)基組分的優(yōu)化，提高CHO細(xì)胞表達(dá)的rhEPOFc的體外活性，以便降低生產(chǎn)成本，為實(shí)現(xiàn)rhEPO-Fc的大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1）細(xì)胞株表達(dá)rhEPO-Fc融合蛋白的CHO細(xì)胞株為本公司構(gòu)建。該細(xì)胞株是在原始細(xì)胞CHO-DG44的基礎(chǔ)上通過(guò)克隆、轉(zhuǎn)染、氨甲喋呤加壓篩選獲得，并馴化成懸浮細(xì)胞。

2）I/F/D培養(yǎng)基在IMDM、DMEM/F12（1∶1）的基礎(chǔ)上，通過(guò)添加必需氨基酸、非必需氨基酸、脂類、轉(zhuǎn)鐵蛋白等血清替代物而自主研發(fā)的無(wú)血清培養(yǎng)基，能夠支持CHO細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增

從液氮罐中取出一管克隆細(xì)胞株，立即浸入37 ℃的水浴中，不斷攪動(dòng)，使之迅速融化。用75%酒精擦拭其外部，于超凈工作臺(tái)用無(wú)菌移液管將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至裝有30 ml I/F/D培養(yǎng)基（含300 μl雙抗）的125 ml搖瓶中，置于Infors Minitron培養(yǎng)箱于37 ℃、5% CO2、120 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)3 d后細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5.0×105的細(xì)胞密度接種至裝有新鮮30 ml培養(yǎng)基的125 ml搖瓶，同上培養(yǎng)5 d，離心（4 ℃，200 g）10 min后取上清測(cè)定其rhEPO-Fc融合蛋白的體外活性。

1.2.2單因素細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

在I/F/D基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的F68、維生素、腐胺、乙醇胺或胰島素，培養(yǎng)5 d后考察它們單獨(dú)或組合對(duì)rhEPO-Fc的體外活性的影響。自維生素開(kāi)始，分別在前一試驗(yàn)優(yōu)化的基礎(chǔ)上再添加所需試驗(yàn)的組分，以不添加所試驗(yàn)的組分為對(duì)照。

1.2.3響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)此前單因素實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)其進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以腐胺（X1）、乙醇胺（X2）、和胰島素（X3）為自變量，rhEPO-Fc融合蛋白體外活性（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，在中心值重復(fù)5次實(shí)驗(yàn)，以確定培養(yǎng)基中各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的最適添加濃度（表1）。

表1　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平(g/L)

1.2.4rhEPO-Fc的體外活性測(cè)定

采用R&D公司人EPO ELISA試劑盒進(jìn)行體外活性測(cè)定[5]。

2　結(jié)果

2.1F68對(duì)rhEPO-Fc體外活性的影響

F68作為一種非離子表面活性劑，加入培養(yǎng)基后，可以在細(xì)胞與氣泡的接觸面形成保護(hù)層，使細(xì)胞免受生物反應(yīng)器和灌流培養(yǎng)中湍流引發(fā)的細(xì)胞剪切壓力，從而對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用[6～8]。當(dāng)不添加F68時(shí)rhEPO-Fc的體外活性為4 926 IU/ml；當(dāng)添加0.5%時(shí)它對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用增加，rhEPO-Fc的體外活性也隨之升高到5 169 IU/ml；當(dāng)添加1% F68時(shí)，rhEPO-Fc體外活性最高可達(dá)為5 427 IU/ml，比不添加F68的對(duì)照提高了10.2%；而后當(dāng)F68濃度繼續(xù)增加到2%時(shí)又會(huì)對(duì)細(xì)胞起到抑制作用，rhEPO-Fc的體外活性又隨之降到5 017 IU/ml。因此在I/F/D基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加最適的F68濃度為1%（圖1）。

2.2維生素對(duì)rhEPO-Fc體外活性的影響

維生素是維持細(xì)胞生長(zhǎng)的重要活性物質(zhì)，通常作為輔酶或者輔基參與代謝的調(diào)控，提供核酸合成的重要底物以及促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝產(chǎn)生能量，參與DNA合成與修復(fù)，保持基因組的穩(wěn)定性[9-10]。當(dāng)添加1% F68而不添加維生素時(shí)，rhEPO-Fc的體外活性為5 406 IU/ml（對(duì)照）；當(dāng)添加5%維生素時(shí)，rhEPO-Fc的體外活性為5 698 IU/ml；當(dāng)添加的維生素濃度達(dá)到10%時(shí)，rhEPO-Fc體外活性最高可達(dá)6 273 IU/ml，比對(duì)照提高了15.6%；而后當(dāng)維生素濃度繼續(xù)增加到20%時(shí)，rhEPO-Fc的體外活性為5 996 IU/ml，變化不明顯。因此在I/F/D基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加維生素的最適濃度為10%（圖1）。

圖1　添加不同組分對(duì)rhEPO-Fc體外活性的影響

2.3腐胺對(duì)rhEPO-Fc體外活性的影響

腐胺是一種聚胺類物質(zhì)，它對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化極其重要，如DNA復(fù)制，轉(zhuǎn)錄及翻譯等。其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控的影響可以通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)循環(huán)機(jī)制和細(xì)胞凋亡來(lái)顯現(xiàn)出來(lái)[10-12]。當(dāng)添加1% F68和10%維生素而不添加腐胺時(shí)rhEPO-Fc的體外活性為6 253 IU/ml（對(duì)照）；在此基礎(chǔ)上添加5 g/L腐胺，rhEPO-Fc的體外活性為6 815 IU/ml；當(dāng)添加的腐胺濃度增加到7.5 g/L時(shí)，rhEPO-Fc體外活性最高可達(dá)7 102 IU/ml，比對(duì)照提高了13.2%；當(dāng)腐胺濃度繼續(xù)增加到10 g/L時(shí)，rhEPO-Fc的產(chǎn)量迅速下降到6 056 IU/ml。因此，添加7.5 g/L腐胺較適宜（圖1）。

2.4乙醇胺對(duì)rhEPO-Fc體外活性的影響

乙醇胺是磷脂酰乙醇胺的前體分子，而磷脂酰乙醇胺在細(xì)胞增殖分列中起到重要作用，因此在培養(yǎng)基中添加乙醇胺能夠促進(jìn)細(xì)胞的合成與增值[10,13]。在上述三培養(yǎng)基組分提高體外活性（7 115 IU/ml，對(duì)照）的基礎(chǔ)上，添加5 g/L乙醇胺時(shí)，rhEPO-Fc體外活性可進(jìn)一步提高到7 639 IU/ml；當(dāng)乙醇胺濃度增加到10 g/L時(shí)，rhEPO-Fc體外活性最高可達(dá)8 403 IU/ml，比對(duì)照提高了18.3%；而當(dāng)乙醇胺濃度繼續(xù)增加到20 g/L時(shí)，rhEPOFc的體外活性又顯著下降到6 892 IU/ml。因此，添加10 g/L乙醇胺較為適宜（圖1）。

2.5胰島素對(duì)rhEPO-Fc體外活性的影響

胰島素促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，調(diào)控糖脂代謝與生物大分子合成，其中包括葡萄糖攝取，糖原合成及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)等[14-16]。2.4項(xiàng)中的添加試驗(yàn)可使rhEPO-Fc的體外活性達(dá)到8 389 IU/ml（對(duì)照）；當(dāng)添加2.5 g/L胰島素時(shí)，rhEPO-Fc的體外活性可進(jìn)一步提高到9 217 IU/ml；當(dāng)添加的胰島素濃度達(dá)到5 g/L時(shí)，rhEPO-Fc體外活性最高可達(dá)10 286 IU/ml，比對(duì)照提高了22.4%；而后當(dāng)胰島素濃度繼續(xù)增加到10 g/L，rhEPO-Fc的體外活性又明顯下降到7 834 IU/ml。因此，添加5 g/L的胰島素較適宜（圖1）。

2.6響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基配比

以上實(shí)驗(yàn)研究了單獨(dú)或組合添加各培養(yǎng)基組分對(duì)rhEPO-Fc的體外活性的影響，但細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中影響rhEPO-Fc的體外活性的因素很多，各組分最適濃度的組合并不一定能獲得最佳結(jié)果，因此本實(shí)驗(yàn)借助Design expert 8.0.5軟件對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基中的腐胺、乙醇胺和胰島素的最適濃度進(jìn)行考察，以尋求rhEPO-Fc的體外活性達(dá)到最大時(shí)的最佳無(wú)血清培養(yǎng)基配比。

2.6.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)腐胺、乙醇胺和胰島素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)3因素3水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，在中心值重復(fù)5次實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次分別取平均值(表2)。

2.6.2多元二次回歸方程的建立及顯著性檢驗(yàn)

利用軟件Design expert 8.0.5對(duì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得rhEPO-Fc體外活性(Y)對(duì)以腐胺(X1)、乙醇胺(X2)、和胰島素(X3)的多元二次回歸方程：

通過(guò)表3回歸模型方差分析表可知模型復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.998 0，說(shuō)明預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間的相關(guān)性很好；Adj R2＝0.995 3，說(shuō)明只有0.47%的變異不能由該模型解釋，因此認(rèn)為可用來(lái)代替真實(shí)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，并且整體模型達(dá)到極顯著水平（P＜0.000 1），表明該二次方程模型顯著。

表2　Box-Benhnken設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

表3　方差分析表

2.6.3響應(yīng)面分析及最優(yōu)培養(yǎng)基條件的確定

借助軟件Design Expert 8.0.5依據(jù)回歸方程來(lái)繪制響應(yīng)曲面圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀（圖2）。

圖2　腐胺、乙醇胺和胰島素對(duì)rhEPO-Fc體外活性影響的響應(yīng)面立體圖

從響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等高線可以看出，在所選范圍內(nèi)存在極值。為求得最佳添加濃度，將所得的多元二次回歸方程(式1)分別對(duì)各自變量求一階偏導(dǎo)數(shù)，并令其為0，得到三元一次方程組，求解此方程組可以得出模型的極值點(diǎn)X1=7.7，X2=10.1，X3=5.38，即當(dāng)腐胺、乙醇胺和胰島素的濃度分別為7.7、10.1和5.38 g/L時(shí)，理論rhEPO-Fc體外活性達(dá)到最大，為10 300 IU/ml。

2.6.4模型驗(yàn)證

為了驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，在I/F/D基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加1% F68、10%維生素、7.7 g/L腐胺、10.1 g/L乙醇胺和5.38 g/L胰島素進(jìn)行近似最佳實(shí)驗(yàn)條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，通過(guò)三次平行實(shí)驗(yàn)rhEPO-Fc的實(shí)際平均體外活性為10 268 IU/ml，比最初使用普通的基礎(chǔ)無(wú)血清培養(yǎng)基的體外活性提高了108.4%，結(jié)果表明響應(yīng)面分析法得到的實(shí)驗(yàn)參數(shù)真實(shí)可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3　討論

CHO細(xì)胞培養(yǎng)是一種獲得高水平表達(dá)重組蛋白的方法，培養(yǎng)基是細(xì)胞賴以體外生長(zhǎng)、增殖、分化的重要因素[17]，可提供細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所必需的全部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[18]，合適的培養(yǎng)基能夠增加細(xì)胞繁殖速度，提高細(xì)胞密度。據(jù)報(bào)道，CHO細(xì)胞表達(dá)的融合蛋白在生物體內(nèi)的生物學(xué)活性、免疫原性、體內(nèi)代謝周期以及拮抗蛋白酶的水解等方面與其培養(yǎng)基成分密切相關(guān)[17]，合適的培養(yǎng)基有利于融合蛋白的表達(dá)，提高其體外活性。無(wú)血清培養(yǎng)基因其組成清楚、批次間重復(fù)性好、制備過(guò)程簡(jiǎn)單、便于下游分離純化及節(jié)省成本等優(yōu)點(diǎn)，已在動(dòng)物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)中得到成功應(yīng)用[19]。因此對(duì)于經(jīng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白的生產(chǎn)工藝而言，篩選優(yōu)化一種無(wú)血清培養(yǎng)基尤為重要。

劉國(guó)慶等[20]報(bào)道在培養(yǎng)基中添加B族維生素能夠有效促進(jìn)CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)并延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中添加了10%的Gibco公司維生素溶液，體外活性提高了15.6%。維生素溶液含有各種類型的維生素，具有互補(bǔ)作用，比單一種類的維生素能較好地促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，增加rhEPO-Fc體外活性。在此基礎(chǔ)上我們后續(xù)可以詳細(xì)地研究各種類型的維生素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，以進(jìn)一步提高rhEPO-Fc的體外活性。俞錦鋒等[16]研究通過(guò)添加胰島素和亞硒酸鈉的混合物來(lái)提高重組蛋白的產(chǎn)量。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加兩者的混合物的確對(duì)體外活性的提高有一定的作用，但亞硒酸鈉不利于后續(xù)的純化工藝，研究其替代物將是一個(gè)難點(diǎn)。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到合適的培養(yǎng)基配比，在進(jìn)行模型驗(yàn)證時(shí)發(fā)現(xiàn)實(shí)際值與理論值存在一定的誤差，這可能是由于實(shí)驗(yàn)是分三批進(jìn)行的，存在批次差異，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中為避免這些誤差可盡量將同一對(duì)照實(shí)驗(yàn)安排在同一批次進(jìn)行，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。

近年來(lái)，國(guó)外的幾個(gè)研究者[21-23]分別報(bào)道了CHO細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖和谷氨酰胺的消耗量、不同非動(dòng)物來(lái)源水解產(chǎn)物以及鋅、銅對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和重組蛋白產(chǎn)量的影響，因此未來(lái)可進(jìn)行添加這些物質(zhì)的試驗(yàn)以及細(xì)胞培養(yǎng)條件如pH[24]、溫度[25]等試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化生產(chǎn)工藝參數(shù)，為放大生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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Effect of the optimization of serum-free medium on the in vitro activity of rhEPO-Fc fusion protein

WANG Yan*, JIANG Ying, LI Ying, ZHOU Yongchun

(Shanghai Chemo Wanbang Biopharma, Shanghai 201506, China)

Objective: To study the effects of the adding different concentrations of various components in the basal culture medium I/F/D on the in vitro activity of rhEPO-Fc. Methods: The optimal components suitable for the expression of rhEPO-Fc were screened by the single factor experimental results combined with Box-Behnken response surface method. Results: When 1% F68,10% vitamin, 7.7 g/L putrescine, 10.1 g/L ethanolamine and 5.38 g/L insulin were added in the basal culture medium, the in vitro activity of rhEPO-Fc was increased by 108.4% up to 10 268 IU/ml compared with the results in the initial basal serum free medium. Conclusion: The in vitro activity of rhEPO-Fc can be increased when cells were incubated in the optimized culture medium, the costs for the production of rhEPO-Fc can be obviously reduced. The results of this study can provide a significant reference for pilot production of rhEPO-Fc.

serum-free medium; putrescine; ethanolamine; insulin

Q813.11

A

1006-1533(2015)23-0074-06

王燕（1986-），女，工學(xué)碩士，主要從事質(zhì)粒構(gòu)建，克隆及細(xì)胞培養(yǎng)等方面的研究。E-mail: yanking86@126.com

2015-08-06)