冷雪嬌，鄧紹林，章 林，黃 明,*，周光宏

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210046；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

高壓腌制對(duì)雞胸肉微觀結(jié)構(gòu)的影響

冷雪嬌1,2，鄧紹林2，章 林2，黃 明2,*，周光宏2

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210046；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

采用食鹽質(zhì)量濃度為40 g/L的腌制液，在不同壓力條件下（0.1、50、100、150、200、300 MPa，保壓時(shí)間20 min）腌制雞胸肉，應(yīng)用低場(chǎng)核磁共振、明場(chǎng)相差顯微鏡和透射電鏡研究雞胸肉在不同壓力條件下微觀結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明：高壓腌制處理對(duì)雞胸肉的水分存在狀態(tài)具有顯著的影響（P＜0.05），300 MPa時(shí)的T22向慢弛豫方向移動(dòng)，150 MPa時(shí)的不易流動(dòng)水占總水分的百分含量最高。150 MPa以下處理組的肌肉組織結(jié)構(gòu)無顯著差異，肌細(xì)胞形狀規(guī)則，排列有序；200 MPa處理下雞胸肉的肌纖維排列疏松，肌纖維之間肌束膜開始破裂；300 MPa處理下雞胸肉的肌束膜發(fā)生大量斷裂和崩解，雞胸肉的肌原纖維結(jié)構(gòu)也發(fā)生明顯變化，Z線和I帶被徹底破壞，在Z線和M線附近形成了重聚體，肌纖維絲發(fā)生消融。150 MPa處理組的雞胸肉肌肉結(jié)構(gòu)保持良好。

高壓；腌制；雞胸肉；微觀結(jié)構(gòu)

腌制是指用食鹽或以食鹽為主，并添加硝酸鈉（或鉀）、亞硝酸鈉、蔗糖和香辛料等腌制輔料處理肉類的過程，是肉制品加工過程中一個(gè)重要的環(huán)節(jié)[1]。常用的腌制方法基本可分為干腌、濕腌、鹽水注射及混合腌制法四種，但基本都存在腌制周期較長(zhǎng)，腌制效率低等問題。超高壓作為近年來新興的一門技術(shù)能夠有效縮短肉制品的腌制周期，提高腌制效率[2-4]，并且還能夠抑制微生物生長(zhǎng)[5]、保持肉品原有的天然色、香、味和營(yíng)養(yǎng)成分[6-10]，從而使得高壓處理的腌制技術(shù)成為新的研究熱點(diǎn)。

目前關(guān)于高壓的研究大多集中在采用相對(duì)較高的壓力，比如400、600 MPa的高壓進(jìn)行殺菌和嫩化，然而過高的壓力會(huì)導(dǎo)致肉的顏色發(fā)白，脂肪發(fā)生氧化[11]等問題，從而使得肉品品質(zhì)下降。但是，在較低壓力下進(jìn)行腌制對(duì)雞胸肉的食用品質(zhì)影響較小，并且，有研究表明高壓能有效提高雞胸肉的腌制速率，150 MPa腌制處理時(shí)食鹽的擴(kuò)散速率最大，另外，高壓腌制還能改善雞胸肉的嫩度，增強(qiáng)保水性[3,12]。

此外，高壓處理可能會(huì)對(duì)肌肉的微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響。肌肉的微觀結(jié)構(gòu)能夠反映出肌肉的品質(zhì)，例如肌纖維直徑的變化能反映肌纖維特性的變化情況、肌纖維的組織學(xué)特性與肌肉品質(zhì)特性，特別是和食用品質(zhì)密切相關(guān)。肌纖維越細(xì)，肌纖維密度越大，保水性越大，肉質(zhì)越細(xì)嫩；肌纖維直徑越大，肌纖維密度越小，保水性越小，肉質(zhì)越老[13]。本實(shí)驗(yàn)從微觀角度出發(fā)，用低場(chǎng)核磁共振（low field-nuclear magnetic resonance，LF-NMR）、明場(chǎng)相差顯微鏡和透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）等技術(shù)，研究雞胸肉在不同壓力條件下微觀結(jié)構(gòu)的變化，以期為高壓條件下腌制雞胸肉食用品質(zhì)的變化提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

24 只三黃雞購(gòu)于南京市童衛(wèi)路農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，每只質(zhì)量約1.5 kg，宰殺取其胸肉，置于4 ℃冷庫(kù)成熟24 h后使用。

1.2 儀器與設(shè)備

UHPF/2L/800MPa型食品高壓設(shè)備 包頭科發(fā)高新技術(shù)食品機(jī)械有限公司；H-600型透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司；SX-40型光學(xué)顯微鏡 日本Akashi公司；1850型冷凍切片機(jī) 德國(guó)Leica公司；PQ001臺(tái)式NMR分析儀 上海紐邁電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高壓處理方法

將成熟24 h后的雞胸肉置于真空包裝袋中，以料液比（m/V）為1∶3加添食鹽質(zhì)量濃度為40 g/L的腌制液，排除氣泡后用封口機(jī)封口，最后置于高壓設(shè)備中進(jìn)行處理。在壓力分別為50、100、150、200、250、300 MPa條件下腌制20 min，以常壓（0.1 MPa）腌制20 min作為對(duì)照。研究表明常溫條件下壓力每升高100 MPa溫度升高3 ℃[14]，為控制高壓腌制時(shí)溫度保持在（25±1）℃，在高壓處理前將傳壓介質(zhì)（蒸餾水）初始溫度降至16～24 ℃，如表1所示[3]。腌制結(jié)束時(shí)取出雞胸肉，用吸水紙擦干肉表面水分，用核磁共振、明場(chǎng)相差顯微鏡和透射電鏡研究雞胸肉在不同壓力處理?xiàng)l件下微觀結(jié)構(gòu)的變化。

表1 高壓腌制時(shí)溫度的控制描述[3]Table 1 Description of temperature control during high pressure brining[3]

1.3.2 不同壓力腌制雞胸肉的NMR水分存在狀態(tài)測(cè)定

取2 g體積約為1 cm×1 cm×2 cm的雞胸肉（來自4 只不同的雞）4 份，分別放入檢測(cè)管中進(jìn)行低場(chǎng)核磁共振檢測(cè)，最后取4 次檢測(cè)結(jié)果的平均值作為鮮雞胸肉的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的弛豫特征值。

將樣品管放入樣品池中，打開核磁共振分析軟件進(jìn)入硬脈沖序列。利用CPMG脈沖序列測(cè)量樣品的自旋-自旋弛豫時(shí)間（T2）。將樣品分別置于磁場(chǎng)中心位置的射頻線圈的中心，利用FID信號(hào)調(diào)節(jié)共振中心頻率，然后進(jìn)行CPMG脈沖序列掃描實(shí)驗(yàn)。參數(shù)設(shè)置為：PulSeqType=2，SF1=22 MHz， O1=482.173 096 kHz，SW=100 kHz，Ds=120，RG1=30，RG2=3，TR=4 000 ms，I=150，EchoCount=500，NS=2。采樣結(jié)束后進(jìn)行T2擬合保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果，然后進(jìn)入T2反演軟件反演出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.3 光學(xué)顯微鏡觀察不同壓力腌制的雞胸肉

從每個(gè)肉樣上順肌纖維方向取0.5 cm×0.5 cm× 0.5 cm肉樣，樣品放入液氮中凍結(jié)12 h，沿肌纖維垂直方向冰凍切片，切片厚度為10 μm。固定于經(jīng)過APES包被的載玻片上，晾片5 min。切片染色步驟：蘇木素染液浸染3 min，70%和80%乙醇梯度脫水，然后用85%乙醇配制的酸化的伊紅溶液染色30 s，80%、90%和100%梯度乙醇脫水，二甲苯通透，中性樹膠封片。制備好的玻片在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

用Image-pro plus 軟件（5.1 MEDIA Cybernetics inc. USA）測(cè)量肌纖維直徑。測(cè)量時(shí)，每張照片隨機(jī)選擇10個(gè)測(cè)量點(diǎn)取平均值。

1.3.4 透射電鏡觀察不同壓力腌制的雞胸肉[15]

將0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的樣品于2.5%戊二醛（25%戊二醛溶液與0.1 mol/L、pH 7.4 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）按1∶9體積比混合即可）中4 ℃固定3 d，然后經(jīng)PBS（pH 7.4）清洗3 次，再于1%餓酸中固定1.5 h，然后再經(jīng)PBS清洗3 次，30 min/次；之后，乙醇逐級(jí)（30%、50%、70%、90%、100%、100%）脫水，每級(jí)20 min；最后用環(huán)氧丙烷置換。脫水后的樣品于Epon-812樹脂和丙酮等體積混合液中滲透4 h，再在純Epon-812樹脂中過夜?jié)B透；然后將樣品包埋，放入聚合器中聚合（35 ℃，24 h；45 ℃，24 h；60 ℃，48 h）聚合后的樣品在實(shí)體顯微鏡下修塊，半薄切片定位，LKB-V超薄切片機(jī)切片；超薄切片用醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色，自然干燥后在透射電子顯微鏡下拍照，用游標(biāo)卡尺測(cè)量肌原纖維直徑，肌節(jié)長(zhǎng)度（兩條Z線之間的距離），每張照片隨機(jī)選擇20 個(gè)測(cè)量點(diǎn)測(cè)量肌節(jié)長(zhǎng)度，觀察肌纖維的微觀結(jié)構(gòu)基本特性。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

所有數(shù)據(jù)均為4次重復(fù)的平均值，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SAS 8.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（one way ANOVA），差異的顯著性采用Duncan’s多重檢驗(yàn)（P＜0.05，差異顯著） 。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同壓力對(duì)腌制雞胸肉中水分存在狀態(tài)的影響

圖1 高壓腌制雞胸肉的NMR的反演圖（n=4）Fig.1 Inversion map of NMR of chicken breast brined by high pressure (n = 4)

圖2 高壓腌制雞胸肉NMR水分分布圖（n=4）Fig.2 Water distribution of NMR in chicken breast brined by high pressure（n=4）

由圖1可知，肉中的水分基本呈現(xiàn)出3 個(gè)波峰，第一個(gè)波峰在1～10 ms之間，第二個(gè)波峰在30～130 ms之間，第三個(gè)波峰則在150～305 ms之間。核磁共振能夠表征氫核在磁場(chǎng)中的弛豫特性，進(jìn)而根據(jù)弛豫特征將水區(qū)分為若干狀態(tài)，以結(jié)合程度來分，肉品中水分可分為結(jié)合水、不易流動(dòng)水和自由水，根據(jù)核磁弛豫時(shí)間可將T2分為T21、T22、T23，分別對(duì)應(yīng)圖1中1～10 ms、30～130 ms和150～305 ms之間的3 個(gè)波峰。

高壓作用下雞胸肉的微觀結(jié)構(gòu)變化可能導(dǎo)致內(nèi)部毛細(xì)管分布改變，水的保持和體系毛細(xì)管作用相關(guān)。由圖1可知，50 MPa和100 MPa腌制雞胸肉時(shí)會(huì)縮短雞胸肉的T2弛豫時(shí)間，與前人的研究結(jié)果相似：Bertram等[16]的研究表明高壓處理會(huì)縮小牛肉的T2時(shí)間，這說明高壓處理會(huì)使肌肉中的水分更加緊密地保留在網(wǎng)狀蛋白中間，從而使肌肉的保水性增加。由圖2可知，經(jīng)過腌制后雞胸肉的T21所占雞胸肉總水分的百分含量幾乎不變，這是因?yàn)檫@些水分都是結(jié)合水，與蛋白質(zhì)分子表面緊密結(jié)合在一起。T22和T23的值和百分含量則不斷變化，結(jié)合常壓腌制發(fā)現(xiàn)，T22對(duì)應(yīng)的不易流動(dòng)水的百分含量隨著壓力的升高先增大后減小，150 MPa的不易流動(dòng)水所占總水分的比例最大。T23對(duì)應(yīng)的是自由水的百分含量則先減小后增大，150 MPa的自由水含量最低，300 MPa的自由水含量最高。

2.2 光學(xué)顯微鏡觀察不同壓力腌制雞胸肉的結(jié)果

圖3 高壓腌制雞胸肉肌纖維的變化（×400）Fig.3 Changes of muscle fi bers in chicken breast brined by high pressure (×400)

圖3 是雞胸肉在不同壓力腌制條件下放大400 倍后微觀結(jié)構(gòu)變化的光學(xué)顯微鏡圖，雞胸肉經(jīng)過高壓腌制后，微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的變化。50～150 MPa處理后，在光學(xué)顯微鏡下，各個(gè)肌肉組織結(jié)構(gòu)有差異但不顯著，雞胸肉的肌細(xì)胞形狀規(guī)則，排列有序；200 MPa雞胸肉的肌纖維排列疏松，肌纖維之間肌束膜開始破裂，300 MPa時(shí)雞胸肉的肌束膜也發(fā)生大量斷裂和崩解，幾乎消失。

圖4 高壓腌制雞胸肉肌纖維直徑的變化（n=4）=4Fig.4 Changes in diameters of muscle fi bers in chicken breast brined by high pressure (n = 4)

由圖4可知，壓力對(duì)腌制雞胸肉的肌纖維直徑影響顯著（P＜0.05），隨著腌制壓力的升高雞胸肉的肌纖維直徑先增加后減小。100 MPa之前肌纖維直徑隨著壓力的升高而增高，這從微觀層面上解釋了本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)雞胸肉肉質(zhì)隨著壓力的升高而變老這一現(xiàn)象[12]。200 MPa以后肌纖維直徑隨著壓力的增高而降低，但本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)200 MPa以后雞胸肉并沒有變嫩[12]，這是因?yàn)?00 MPa以后肌束膜發(fā)生破裂，導(dǎo)致肌纖維束松散，肌纖維直徑并沒有真正的變小。

2.3 透射電鏡觀察不同壓力腌制雞胸肉的結(jié)果

圖5 高壓腌制雞胸肉肌纖維的縱切面變化Fig.5 Changes in longitudinal section of muscle fi bers in chicken breast brined by high pressure

不同壓力條件下腌制雞胸肉的微觀結(jié)構(gòu)如圖5所示，0.1、50 MPa條件下腌制的雞胸肉有清晰可見的M線、Z線，這些線附近的H帶、I帶，以及I帶之間的A帶。兩條Z線之間的部分叫做肌節(jié)，很多個(gè)肌節(jié)單元組成了肌原纖維。100、150 MPa壓力處理后雞胸肉的H帶已經(jīng)開始模糊，但肌節(jié)仍然清晰可見。200 MPa時(shí)H帶已經(jīng)徹底消失，I帶也在減小。300 MPa條件下腌制的雞胸肉肌原纖維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著的變化，Z線和I帶被徹底破壞，在Z線和M線附近形成了重聚體，肌纖維絲也發(fā)生了消融。

高壓處理后肌肉微觀結(jié)構(gòu)的變化會(huì)因壓力水平和肉類品種的不同而不同。Iwasaki等[17]用免疫電子顯微鏡觀察高壓處理后的雞肉，證實(shí)用大于200 MPa的壓力保壓10 min可以破壞雞肉肌原纖維的Z線。而對(duì)于豬肉，當(dāng)壓力升至400 MPa和500 MPa時(shí)才觀察到A帶斷裂[18]。Villacís等[2]則用透射電鏡觀察到高壓腌制火雞胸肉時(shí)，150 MPa時(shí)肌原纖維發(fā)生溶脹，M線消失，Z線斷裂，A帶和I帶縮短，肌節(jié)長(zhǎng)度短于對(duì)照組，這是由高壓的壓縮作用引起的，Z線的破裂是因?yàn)榕cZ線相連的肌原纖維細(xì)絲的基本構(gòu)成部分F-actin發(fā)生變性；300 MPa時(shí)肌原纖維發(fā)生巨大的變化，Z線和I帶被徹底破壞，在Z線和M線附近形成一個(gè)非常密集的再凝集物質(zhì)，從而使肉品的保水性下降。對(duì)于魚肉來說，小于150 MPa的壓力就可以導(dǎo)致Z線破壞和A帶斷裂，這可能是由于不同肉類肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)不同所致，而150 MPa處理后，肌肉的肌節(jié)收縮，肌原纖維變粗，Z線、M線和H區(qū)消失，粗絲和細(xì)絲零亂交錯(cuò)，A帶和I帶斷裂，經(jīng)450 MPa處理后，肌原纖維的肌節(jié)己被徹底破壞，難以辨認(rèn)A帶和I帶，肌原纖維間隙消失，蛋白質(zhì)膠凝化現(xiàn)象嚴(yán)重[19]。因此，對(duì)于不同品種的肉，不同的壓力強(qiáng)度和處理時(shí)間，會(huì)對(duì)肉的品質(zhì)產(chǎn)生不同的影響。

圖6 高壓腌制雞胸肉肌節(jié)長(zhǎng)度的變化（n=4）Fig.6 Changes in sarcomere length of chicken breast brined by high pressure (n = 4)

肌纖維是禽肉的基本構(gòu)造單位，其直徑的變化反映了肌纖維特性的變化情況。許多研究表明，肌纖維的組織學(xué)特性與肌肉品質(zhì)特性特別是食用品質(zhì)性狀密切相關(guān)[13]，嫩度決定于肌纖維和肉中的結(jié)締組織，其中肌纖維的作用更大一些。一般認(rèn)為，肌纖維絲越細(xì)，密度越大，系水力越強(qiáng)，肉質(zhì)越細(xì)嫩。肌節(jié)長(zhǎng)度也對(duì)嫩度具有很大程度的決定作用，肌節(jié)長(zhǎng)度越長(zhǎng)，肌肉越細(xì)嫩[20]。由圖6可知，不同壓力下雞胸肉肌節(jié)長(zhǎng)度具有顯著的變化（P＜0.05），與常壓腌制相比，50、100 MPa的肌節(jié)長(zhǎng)度稍長(zhǎng)，而150 MPa之后肌節(jié)長(zhǎng)度則慢慢降低，這與150 MPa之后剪切力值的上升[6]有很大關(guān)系。

3 結(jié) 論

高壓處理對(duì)腌制雞胸肉的水分存在狀態(tài)具有顯著的影響（P＜0.05），150 MPa處理腌制雞胸肉的不易流動(dòng)水占總水分的百分含量最高，自由水占總水分的百分比最低。壓力小于150 MPa的處理組在光學(xué)顯微鏡下各個(gè)肌肉組織結(jié)構(gòu)沒有顯著差異且雞胸肉的肌細(xì)胞形狀規(guī)則，排列有序，100、150 MPa的H帶已經(jīng)開始模糊，但肌節(jié)仍然清晰可見，200 MPa時(shí)H帶已經(jīng)徹底消失，I帶也在減小，300 MPa時(shí)肌原纖維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著的變化，Z線和I帶被徹底破壞，在Z線和M線附近形成了重聚體，肌纖維絲也發(fā)生了消融，因此150 MPa處理組的雞胸肉肌肉結(jié)構(gòu)保持較好。

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Effect of High Pressure Brining on Microstructure of Chicken Breast

LENG Xuejiao1,2, DENG Shaolin2, ZHANG Lin2, HUANG Ming2,*, ZHOU Guanghong2
(1. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China; 2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The objective of this study was to investigate the effect of high pressure brining on microstructure of chicken breast. Chicken breast was brined under different pressure levels (0.1, 50, 100, 150, 200 or 300 MPa for 20 min) in 40 g/L salt solution. Nuclear magnetic resonance (NMR), optical microscope and transmission electron microscopy (TEM) were used to characterize the microstructure of chicken breast. The results showed that high pressure brining had signifi cant effects on the state of water in chicken breast (P < 0.05). At 300 MPa, T22was shifted towards to slow relaxation direction, and more immobile water than free water at 150 MPa was observed. At a pressure less than 150 MPa, some differences but not obvious in the muscle cell shape were observed. Chicken breast muscle fi ber arranged loosely at 200 MPa, and muscle fi ber perimysium began to burst at 200 MPa. When brining at 300 MPa, the perimysium of chicken breast muscle become disintegrated. Chicken myofi brillar structure brined at 300 MPa had a signifi cant change; Z line and I band were completely destroyed, thus forming a reunion body near them, and the ablation of fi bers was also observed. Therefore, 150 MPa could provide better maintenance of muscle fi ber structure.

high pressure; brining; chicken breast; microstructure

TS251.1

A

1002-6630（2015）01-0099-05

10.7506/spkx1002-6630-201501019

2014-03-06

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK2009314）；南京中醫(yī)藥大學(xué)校青年自然科學(xué)基金項(xiàng)目（13XZR29）

冷雪嬌（1988—），女，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩c工藝。E-mail：leng.xuejiao2008@163.com

*通信作者：黃明（1970—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槿忸愘|(zhì)量與安全控制。E-mail：mhuang@njau.edu.cn