何曉梅，古莉娜

（安徽大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，安徽 合肥 230601）

羥基磷灰石，又稱羥磷灰石，是鈣磷灰石（Ca5（PO4）3（OH））的自然礦物化.其經(jīng)常被寫成（Ca10（PO4）6（OH）2）的形式以突出它是由兩部分組成的：羥基與磷灰石.羥基磷灰石是脊椎動(dòng)物骨骼和牙齒的主要組成，人的牙釉質(zhì)中羥基磷灰石的含量在96%以上.羥基磷灰石，由于其獨(dú)特的性質(zhì)，從普通的羥基磷灰石到納米羥基磷灰石一直都是人們研究的熱點(diǎn).納米羥基磷灰石具有溶解度高、生物相容性好、比表面積大等特點(diǎn).近年來，制備納米羥基磷灰石的方法有很多，例如：水熱法［1－3］、微乳液法［4－5］、模擬體液法［6－7］、模板法［8－10］、溶膠凝膠法［11－12］、化學(xué)沉淀法［13］.其中，水熱法具有制備晶粒的尺寸可控、顆粒團(tuán)聚現(xiàn)象少或無團(tuán)聚、純度高、結(jié)晶完整等優(yōu)點(diǎn)，是一種低能耗、低污染的方法，而且粉體質(zhì)量好，產(chǎn)量也較高.

Ijntema等［14］最先采用共沉淀法將蛋白類藥物包裹于納米晶粒中，成功獲得了具有緩釋功能的藥物釋放體系，并進(jìn)一步研究證明了該體系可有效地控制藥物的釋放速率.由于納米HA與蛋白質(zhì)分子之間具有極好的生物相容性和極高的親和力，其已被廣泛用于蛋白類緩釋藥物的緩釋載體［15－18］.在藥劑學(xué)領(lǐng)域，藥物緩釋系統(tǒng)是重要的研究方向之一；作為藥物制劑的前沿領(lǐng)域，藥物緩釋系統(tǒng)引起了制藥工業(yè)的廣泛關(guān)注.

作者結(jié)合氣液沉淀法和水熱法，成功地合成了棒狀的介孔HA納米粒子.以牛血清白蛋白（BSA）為模式蛋白藥物，考察了BSA在HA上的吸附行為以及HA－BSA復(fù)合物的體外釋放行為.結(jié)果表明，介孔納米HA可以作為蛋白藥物載體且能實(shí)現(xiàn)藥物的可控制釋放.

1 試驗(yàn)材料和試驗(yàn)方法

1.1 試驗(yàn)材料

牛血清白蛋白（BSA，分子量67 000，等電點(diǎn)4.8）購于上海源聚生物科技有限公司，硝酸鈣購于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，無水乙醇購于上海振興化工一廠，磷酸氫二氨購于西隴化工股份有限公司，氨水購于上海博河精細(xì)化學(xué)品有限公司.上述化學(xué)試劑均為分析純.

1.2 羥基磷灰石的合成

稱取2.951 9g四水合硝酸鈣和0.990 5g磷酸氫二氨分別溶于50mL無水乙醇及50mL蒸餾水中.將盛有硝酸鈣溶液的小燒杯置于裝有100mL氨水的密封大燒杯中，在氨氣的作用下，硝酸鈣溶液的pH被調(diào)節(jié)到10.5左右.在這種堿性環(huán)境下，邊攪拌邊緩慢滴加磷酸氫二銨水溶液.滴加完畢后，繼續(xù)攪拌2h，然后將渾濁液倒入反應(yīng)釜中，120℃條件下水熱24h.用超純水和無水乙醇多次洗滌產(chǎn)物，60℃下干燥12h，研磨，即得樣品.

1.3 羥基磷灰石納米粒子的表征

采用X射線衍射（XRD，XD－3，CuKα＝1.541 8，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、透射電鏡（TEM，JEM－2100，Japan）、比表面分析（BET，ASAP 2020M＋C，U.S.A）、傅立葉紅外光譜（FT－IR，NEXUS－870，U.S.A）確定 HA的結(jié)構(gòu).

1.4 蛋白吸附試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取20mg羥基磷灰石納米粒子置于10mL不同濃度的BSA溶液中，在恒溫氣浴振蕩器上振蕩10h.高速離心（10 000rpm，18min）后，移出一定量的上清液，用紫外分光光度法（UV－Vis，UVU－4100，Japan）測(cè)定上清液中蛋白的含量（選取波長為280nm），從而確定蛋白的吸附量.

1.5 HA－BSA復(fù)合物體外釋放試驗(yàn)

精密稱取30mg羥基磷灰石納米粒子－牛血清白蛋白復(fù)合物，置于37℃不同pH的10mL磷酸緩沖液中振蕩.在設(shè)定時(shí)間下停止振蕩，高速離心后取出5mL上清液，用紫外分光光度法測(cè)定其蛋白質(zhì)釋放量.同時(shí)，向反應(yīng)容器中補(bǔ)充5mL新鮮的磷酸緩沖液.

2 結(jié)果與討論

2.1 HA的表征

圖1為所制備HA的X射線衍射圖.

從圖1可以看出，各衍射峰峰形尖銳，位置和強(qiáng)度均與標(biāo)準(zhǔn)PDF卡片（JCPDS 09－0432）上的HA特征衍射峰吻合，表明該法合成的HA結(jié)晶程度很好，產(chǎn)物純度很高.

樣品的透射電鏡照片如圖2所示.

由圖2可見，所制得的產(chǎn)物為分散性良好的棒狀顆粒，顆粒尺寸比較均勻，長度為100～150nm，寬度約為40nm.另外，HA顆粒上具有明顯的介孔結(jié)構(gòu)，介孔的孔徑約為4nm.

圖3為HA的氮?dú)馕剑摳降葴厍€（a）和BJH孔徑分布圖（b）.

從HA的氮?dú)馕剑摳降葴厍€中可以看出，曲線具有明顯的滯后環(huán)，屬于典型的IV類等溫線，表明樣品具有介孔結(jié)構(gòu).由孔徑分布圖可以看出HA中的孔主要分布在4nm左右和20～50nm之間.結(jié)合電鏡照片可以判斷出4nm左右的介孔屬于顆粒內(nèi)孔，而20～50nm左右的孔可能是顆粒間孔.根據(jù)BET計(jì)算，HA的比表面積為87.3m2·g－1，孔體積為0.338cm3·g－1.BET分析結(jié)果表明，該樣品比表面積較大，具有介孔結(jié)構(gòu)，因此能夠用作藥物載體，且藥物能夠進(jìn)入介孔內(nèi)，可以有效減少藥物突釋，延長釋放周期.

圖4是BSA、HA及HA－BSA復(fù)合物的紅外光譜圖.

圖4中曲線a為牛血清蛋白的紅外圖譜，其中1 660～1 650cm－1歸屬于N—H特征峰，而1 670 cm－1屬于特征峰；曲線b為羥基磷灰石的紅外圖譜，其中3 571cm－1和1 634cm－1屬于OH－1特征峰，而565、603、1 039、1 099cm－1歸屬于PO43－特征峰；曲線c中同時(shí)出現(xiàn)了牛血清蛋白和羥基磷灰石的特征峰，因此可以確定牛血清蛋白確實(shí)吸附在羥基磷灰石上，形成了HA－BSA復(fù)合物.

2.2 等溫吸附曲線和吸附機(jī)理

圖5為BSA在HA上的等溫吸附曲線，BSA在HA上的吸附量可通過吸附前后的BSA濃度變化來獲得.

在圖5的等溫吸附線上，吸附量逐漸趨向于一個(gè)極值，說明HA和BSA之間存在著吸附平衡.300、305、310K條件下的飽和吸附量分別為120、130、140mg·g－1.其吸附量大于Nagata等［19］水熱合成的HA納米顆粒（最大比表面積為120.8m2·g－1，對(duì)BSA的最大吸附量為1mg·m－2，吸附量可換算成120.8m2·g－1）；小于Zhao等［20］合成的由納米片（＜50nm）組成的具有立體、分層納米結(jié)構(gòu)的花瓣?duì)钗⒚准?jí) HA（尺寸在1～3μm，比表面積為54.4m2·g－1，對(duì)BSA的吸附量為165mg·g－1）.

由于固體在溶液中的吸附是一個(gè)復(fù)雜的過程，受到固體與溶質(zhì)、固體與溶劑、溶質(zhì)與溶劑等相互作用的影響，因此固體吸附理論并不完整，固體在溶液中的吸附經(jīng)常使用氣體吸附模型進(jìn)行表征，其中最常用的是Langmuir模型和Freundlich模型.公式（1）、（2）分別是Langmuir模型和Freundlich模型的線性表達(dá)形式.

Langmuir模型

Freundlich模型

其中：qe為 HA對(duì)BSA的平衡吸附量：μg·mg－1；ce為BSA溶液的平衡濃度：mg·mL－1；qmax為 HA對(duì)BSA的飽和吸附量：μg·mg－1；k為吸附系數(shù)；n為常數(shù).分別用Langmuir模型和Freundlich模型對(duì)上述吸附數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，結(jié)果如圖6、7所示.由兩圖中的擬合結(jié)果可知，HA對(duì)BSA的吸附更符合Langmuir吸附模型，這也與吸附等溫線的變化趨勢(shì)一致.

2.3 HA－BSA復(fù)合物的體外釋放

HA－BSA復(fù)合物在磷酸緩沖液中的體外釋放曲線如圖8所示.由圖8可知，在中性環(huán)境條件下，初始4h內(nèi)BSA釋放率為10.86%，突釋現(xiàn)象不明顯；隨后BSA的釋放速度開始減緩，釋放率隨時(shí)間的延長基本呈直線增加，持續(xù)釋放70h后累計(jì)釋放率達(dá)78.89%.而滕利榮等［21］合成的納米HA顆粒（寬為20～30nm，長為50～60nm）在中性環(huán)境下20min內(nèi)BSA釋放率達(dá)15%，持續(xù)釋放200min后累計(jì)釋放率達(dá)65%左右；Swain等［22］合成了3種形貌的HA顆粒（球形、棒狀、纖維形，其晶粒尺寸分別為9、12、16nm，比表面積分別為256、217、47m2·g－1，對(duì)BSA的吸附量分別為26.5、28、25.7mg·g－1），在中性環(huán)境下的BSA累計(jì)釋放率都在10h內(nèi)突釋14%左右，隨后BSA的釋放速度開始加快，持續(xù)釋放90h后累計(jì)釋放率為70%.由此可以看出，雖然該法制備的HA比表面積不是很大，但是對(duì)BSA的吸附和緩釋效果都較好，有可能成為蛋白類藥物的合適載體.

另外，從圖8中還可以看出，BSA在pH為5.6緩沖液中的累計(jì)釋放率要低于在pH為7.0緩沖液中的釋放率，這一點(diǎn)與文獻(xiàn)［21］中的結(jié)果一致.可能的原因是BSA與HA之間存在著電荷相斥效應(yīng).由于BSA在pH為5.6的緩沖液中所帶負(fù)電荷量要低于在pH為7.0緩沖液中所帶電荷量，因此在pH為5.6的緩沖液中的電荷相斥效應(yīng)低于在pH為7.0緩沖液中的相斥效應(yīng)，相應(yīng)地，BSA在pH為5.6緩沖液中的釋放率要低于在pH為7.0緩沖液中的釋放率.

為了闡明HA－BSA復(fù)合物中BSA的釋放機(jī)制，可以根據(jù)Korsmeyer－Peppas方程［23－25］對(duì)累積釋放數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合.公式（3）即為Korsmeyer－Peppas方程，公式（4）是其線性形式.

其中：F為累計(jì)釋放百分率；t為釋放時(shí)間；k為釋藥常數(shù)，是表征釋放速率大小的常數(shù)；n為釋放參數(shù)，是表征釋放機(jī)制的特征參數(shù).當(dāng)0.45＜n＜0.89時(shí)，藥物釋放機(jī)制為非Fickian擴(kuò)散（即藥物擴(kuò)散和骨架溶蝕協(xié)同作用）；當(dāng)n＜0.45時(shí)，為Fickian擴(kuò)散；當(dāng)n＞0.89時(shí)，為骨架溶蝕機(jī)制［26］.

圖9為兩種不同pH條件下BSA釋放的擬合曲線，表1為擬合結(jié)果.

表1 HA－BSA復(fù)合物中藥物釋放過程的擬合參數(shù)Tab.1 Model parameters for the dissolution of model drug from HA－BSA

從擬合結(jié)果可以看出，擬合曲線的線性關(guān)系良好，釋放參數(shù)分別為0.658（pH＝7.0）、0.633（pH＝5.6）.這說明該實(shí)驗(yàn)中BSA分子的釋放很好地符合了非Fickian擴(kuò)散.

3 結(jié)束語

作者成功地合成了介孔HA納米顆粒，純度高、分散性好.以BSA為模式蛋白，測(cè)定了在不同溫度下的吸附等溫線，310K時(shí)的飽和吸附量可達(dá)到140μg·mg－1.用不同模型對(duì)吸附等溫曲線進(jìn)行模擬，結(jié)果表明可以用Langmuir模型來描述HA對(duì)BSA的吸附行為.作者探索了HA－BSA復(fù)合物的體外釋放行為：pH為5.6的磷酸緩沖液中的累積釋放量低于pH為7.0的釋放量；其釋放機(jī)制為非Fickian擴(kuò)散.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HA－BSA復(fù)合物的體外釋放行為具有釋放平緩，突釋小，持續(xù)時(shí)間較長，累計(jì)釋放率較大等特點(diǎn)，因此，HA納米粒子有望作為蛋白類緩釋藥物的載體.

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