王威 廖蘇平 危蕾 吳波 劉俊

·實(shí)驗(yàn)研究論著·

納米纖維支架對(duì)人肌腱成纖維細(xì)胞的生長及相關(guān)基因表達(dá)的影響

王威 廖蘇平 危蕾 吳波 劉俊

目的 研究人肌腱成纖維細(xì)胞(tendon derived fibroblasts, TDFs)在聚乳酸(poly-L-lactic acid, PLLA)納米纖維支架及聚乳酸/Ⅰ型膠原蛋白(PLLA/Col-Ⅰ)納米纖維支架上的生長情況及相關(guān)基因的表達(dá)情況。方法 將TDFs分別種植于空白蓋玻片(空白組)、載有PLLA納米纖維支架的蓋玻片(PLLA組)和載有PLLA/Col-Ⅰ納米纖維支架的蓋玻片上(PLLA/Col-Ⅰ組)，觀察細(xì)胞生長情況，并檢測(cè)Ⅰ、Ⅲ、Ⅹ型膠原蛋白(Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅹ)以及整合素相關(guān)基因黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)的基因表達(dá)情況。結(jié)果 PLLA組細(xì)胞生長速度低于空白組和PLLA/Col-Ⅰ組，而PLLA/Col-Ⅰ組和空白組相比，細(xì)胞生長速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。和PLLA組及空白組相比，PLLA/Col-Ⅰ組中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅹ以及FAK基因表達(dá)水平顯著升高，PLLA組和空白組無明顯區(qū)別。結(jié)論 PLLA/Col-Ⅰ納米纖維支架對(duì)TDFs的生長有促進(jìn)作用，且有利于Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅹ及FAK基因的表達(dá)，能為肌腱修復(fù)提供一種理想的組織工程支架材料。

肌腱；成纖維細(xì)胞；納米纖維；聚乳酸；Ⅰ型膠原蛋白

肌腱缺損是臨床常見的疾患之一，未能及時(shí)予以修復(fù)常會(huì)導(dǎo)致機(jī)體功能障礙，甚至殘廢。因而對(duì)缺損肌腱的修復(fù)和重建是臨床重要的研究課題之一。目前臨床上常行自體肌腱移植修復(fù)、同種異體肌腱移植或異種肌腱移植治療等，然而由于供體肌腱缺乏、免疫排斥等原因往往限制了其治療效果[1，2]。隨著細(xì)胞培養(yǎng)和移植技術(shù)的發(fā)展，以及生物材料學(xué)的進(jìn)步，組織工程化人工肌腱成為研究熱點(diǎn)之一，并有望最終解決肌腱缺損問題[3]。

理想的肌腱修復(fù)支架需要滿足以下條件：①與肌腱細(xì)胞相容；②有利于細(xì)胞的遷徙和增殖；③在愈合過程中，能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的形成?；陔娮蛹徑z制備的納米纖維支架具有許多優(yōu)點(diǎn)：與人類的細(xì)胞外基質(zhì)形態(tài)相似，具有非常細(xì)微的連續(xù)性的纖維，高表面積與容量比，多孔性等。這些性能可促使細(xì)胞在支架上黏附、增殖并促進(jìn)營養(yǎng)物、廢物的運(yùn)輸?shù)萚4]。與其他支架制備技術(shù)相比，電紡技術(shù)高效快速、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作容易，便于控制化學(xué)組分和物理性能[5]，且能通過許多聚合物制造出來，如多聚甘醇酸、聚乳酸(poly-L-lactic acid, PLLA)、膠原蛋白、聚氨基葡萄糖等[6]，具有生物相容性及可降解性。

有研究顯示電子紡絲制備的含有PLLA/Ⅰ型膠原(PLLA/Col-Ⅰ)的納米纖維是適合骨缺損的移植修復(fù)物，能促進(jìn)干細(xì)胞的骨形成分化和生長[7]。而關(guān)于其對(duì)人肌腱成纖維細(xì)胞(tendon derived fibroblasts, TDFs)的生長和相關(guān)基因表達(dá)的影響鮮見報(bào)道。本研究通過試驗(yàn)重點(diǎn)觀察納米纖維支架對(duì)TDFs的生長和相關(guān)基因表達(dá)的影響，并對(duì)PLLA納米纖維支架和PLLA/Col-Ⅰ納米纖維支架進(jìn)行比較。

材料與方法

一、PLLA納米纖維支架的制備

以六氟異丙醇為溶劑，在室溫下與PLLA溶液(Mw=1.0×105，Tg=57.9 ℃，深圳光華偉業(yè)實(shí)業(yè)有限公司)混合并持續(xù)攪拌3 d，最終得到重容比為4.5%的溶液。將制備好的溶液裝入毛細(xì)微管后置入高靜電場(chǎng)制備納米纖維支架。電紡條件：流速為14 μL/min，外加電壓18 kV，接收裝置距離為15 cm。PLLA納米纖維收集在19 mm蓋玻片上。將制備好的PLLA納米纖維支架放入通風(fēng)櫥中干燥過夜備用。

二、PLLA/Col-Ⅰ納米纖維支架的制備

將Col-Ⅰ與PLLA溶液按4∶1的比例溫和攪拌制成PLLA/Col-Ⅰ混合溶液，再按上述步驟電紡制備出PLLA/Col-Ⅰ納米纖維支架備用。

三、TDFs的分離及培養(yǎng)

肌腱來源于手術(shù)中廢棄的肌腱組織，以生理鹽水反復(fù)沖洗3遍，再以0.25%氯霉素溶液浸泡30 min，之后去除肌腱組織的腱鞘膜，剪成2 mm3左右的小塊，在37 ℃下使用膠原酶消化30 min。去掉膠原酶，使用PBS漂洗，隨后種植于含有10%小牛血清及1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)皿上，放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1周后，當(dāng)細(xì)胞從肌腱上遷徙并附著于培養(yǎng)皿上以后，去除肌腱塊，貼壁的細(xì)胞進(jìn)行下一步的培養(yǎng)。

TDFs按3×104個(gè)/cm2的密度種植于三組蓋玻片上：空白組，為空白蓋玻片；PLLA組，蓋玻片上覆蓋含PLLA的納米纖維；PLLA/Col-Ⅰ組，蓋玻片上覆蓋含PLLA/Col-Ⅰ的納米纖維。將各組培養(yǎng)在含低糖、低谷氨酸以及10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。隔日更換1次培養(yǎng)液。

四、細(xì)胞免疫熒光染色

細(xì)胞培養(yǎng)5 d后，取出蓋玻片用PBS進(jìn)行漂洗，然后使用濃度為5 μg/mL 的二乙酸熒光素(fluorescein diacetate, FDA)進(jìn)行染色。使用萊卡DM5000熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，并用高倍顯微攝像。利用Quips分析軟件進(jìn)行分析。

五、檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)

主要檢測(cè)Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅹ、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、整合素相關(guān)基因黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)等基因的表達(dá)情況。

1.逆轉(zhuǎn)錄過程 分別在培養(yǎng)的第5、10、20天采用異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法提取總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Boehringer mannheim產(chǎn)品)合成cDNA，20 μL反應(yīng)體系主要包括：反應(yīng)緩沖液、10 mmol/L dNTP、1 μg 總RNA、50 U RNase inhibitor、50 U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、1.6 μg oligo-dT，于42 ℃反應(yīng)30 min，99 ℃下5 min，終止反應(yīng)。

2.PCR擴(kuò)增 建立100 μL的反應(yīng)體系，主要成分如下：反應(yīng)緩沖液、10 mmol/L dNTP、引物(見表1，同時(shí)選用β-actin作內(nèi)參)、2～3 μL cDNA產(chǎn)物、5 U Taq DNA聚合酶。95 ℃下10 min預(yù)變性，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，每循環(huán)94 ℃、60 ℃、72 ℃各1 min，最后1個(gè)循環(huán)72 ℃保持10 min。

目標(biāo)基因的分析使用Delta-delta Ct以及Cyber Green。

表1 RT-PCR擴(kuò)增中使用的引物序列

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、細(xì)胞免疫熒光染色

通過熒光染色觀察，空白組與PLLA/Col-Ⅰ納米纖維組細(xì)胞密度差別不大，而PLLA納米纖維組細(xì)胞密度顯著降低(圖1a～c)。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析各組中FDA陽性細(xì)胞占比，空白組與PLLA/Col-Ⅰ納米纖維組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而PLLA納米纖維組細(xì)胞密度與空白組及PLLA/Col-Ⅰ納米纖維組相比顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

二、對(duì)膠原蛋白基因表達(dá)的影響

在細(xì)胞培養(yǎng)的第5、10、20天，檢測(cè)Col-Ⅰ基因表達(dá)情況。如圖3所示各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，PLLA納米纖維組中Col-Ⅰ基因的表達(dá)與空白組沒有明顯差異。而PLLA/Col-Ⅰ納米纖維組中Col-Ⅰ基因的表達(dá)與空白組和PLLA納米纖維組兩組相比明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。各組中Col-Ⅰ基因的表達(dá)均在第10天達(dá)到高峰。

在肌腱修復(fù)中，Col-Ⅲ和Col-Ⅹ同樣重要。結(jié)果顯示空白組、PLLA納米纖維組兩組中各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上Col-Ⅲ基因的表達(dá)均無明顯差異。PLLA/Col-Ⅰ納米纖維組與空白組、PLLA納米纖維組相比，在第5天時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是在第10天和第20天時(shí)，PLLA/Col-Ⅰ納米纖維組中Col-Ⅲ基因的表達(dá)明顯高于空白組和PLLA納米纖維組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，且后期Col-Ⅲ在PLLA/Col-Ⅰ納米纖維組中的表達(dá)呈增長趨勢(shì)，見圖4。

Col-Ⅹ基因的表達(dá)與Col-Ⅰ相似，空白組與PLLA納米纖維組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第5、10天時(shí)PLLA/Col-Ⅰ納米纖維組中Col-Ⅹ基因的表達(dá)均高于其他兩組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，而且各組中Col-Ⅹ基因的表達(dá)高峰均在第10天，見圖5。

三、對(duì)FAK基因表達(dá)的影響

本研究顯示各個(gè)時(shí)間點(diǎn)FAK的基因表達(dá)在PLLA/Col-Ⅰ納米纖維組中的表達(dá)均比空白組和PLLA納米纖維組中顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見圖6。

圖1 TDFs培養(yǎng)5 d時(shí)免疫熒光染色結(jié)果(×100) a：空白組；b：PLLA納米纖維組；c：PLLA/Col-Ⅰ納米纖維組

圖2 各組FDA陽性細(xì)胞占比統(tǒng)計(jì)圖

圖3 各組中Col-Ⅰ基因的表達(dá)情況

圖4 各組中Col-Ⅲ基因的表達(dá)情況

圖5 各組中Col-Ⅹ基因的表達(dá)情況

圖6 各組中FAK基因的表達(dá)情況

討 論

PLLA是一種可生物降解的熱塑性脂肪族聚酯，主要原料乳酸又是可再生資源，無毒副作用，具有良好的生物相容性，可塑性好，有著廣泛的研究和應(yīng)用前景，被認(rèn)為是最有前途的生物醫(yī)用材料和新型包裝材料之一[8]。Col-Ⅰ是一組由多種糖蛋白組成的大家族，不僅具有合成高分子不可比擬的生物相容性、降解性和低抗原性，而且具有一系列重要的生物學(xué)功能，因其可轉(zhuǎn)化為生物醫(yī)學(xué)材料，漸漸引起人們的關(guān)注[9，10]。

組織工程支架是組織工程研究的重要組成部分，支架所形成的三維結(jié)構(gòu)不但為細(xì)胞獲取營養(yǎng)、生長和代謝提供了一個(gè)有利的空間，也為植入的細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)最終形成相應(yīng)的組織或器官提供了一個(gè)良好的環(huán)境。靜電紡絲技術(shù)是制備組織工程支架材料最有效的方法之一[11]。

以PLLA為原料制備的納米纖維支架已廣泛應(yīng)用于組織工程中骨和軟骨組織的構(gòu)建和再生，通過在材料上培養(yǎng)組織細(xì)胞，并逐漸生長成組織和器官。目前對(duì)包括軟骨、皮膚、神經(jīng)和血管等培養(yǎng)的研究己經(jīng)取得可喜的進(jìn)展[12-14]。而關(guān)于TDFs在PLLA納米纖維支架上的生長能力和基因表達(dá)情況，以及聯(lián)合應(yīng)用PLLA和Col-Ⅰ制備納米纖維支架的研究卻鮮見報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，與玻璃表面相比，PLLA納米纖維支架培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)目顯著下降，提示PLLA納米纖維可能影響TDFs的增殖。具體原因可能是PLLA納米纖維支架結(jié)構(gòu)不利于TDFs細(xì)胞生長。亦有研究利用PLLA納米纖維培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察到與玻璃表面相比，Ki67單抗細(xì)胞陽性率降低[15]。

還有研究發(fā)現(xiàn)PLLA納米纖維對(duì)細(xì)胞密度的這種抑制作用會(huì)在PLLA中加入Col-Ⅰ后抵消，這提示膠原蛋白能夠抵消PLLA對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。

細(xì)胞外基質(zhì)的形成對(duì)于肌腱的修復(fù)及生長具有重要作用。Col-Ⅰ是肌腱的重要成分，并且與肌腱的抗拉強(qiáng)度密切相關(guān)[16]。因此，理想的支架應(yīng)該能夠利于Col-Ⅰ的生長。培養(yǎng)在PLLA/Col-Ⅰ納米纖維上的TDFs數(shù)量及Col-Ⅰ的基因表達(dá)都得到了增長，而在PLLA納米纖維中卻沒有這樣的效果。除了Col-Ⅰ，Col-Ⅲ和Col-Ⅹ等細(xì)胞外基質(zhì)成分與肌腱修復(fù)也密切相關(guān)[17]。本研究顯示同PLLA納米纖維組及空白組相比，在PLLA/Col-Ⅰ納米纖維中，Col-Ⅲ和Col-Ⅹ的表達(dá)均明顯升高。

整合素為親異性細(xì)胞黏附分子，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與胞外基質(zhì)間的相互作用，以及胞內(nèi)信號(hào)和胞外信號(hào)的相互通訊。黏著斑是連接胞內(nèi)和胞外環(huán)境的重要信號(hào)分子復(fù)合物，其中最重要的是FAK。FAK是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，它可通過整合細(xì)胞外信號(hào)和介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的一系列生化反應(yīng)來調(diào)節(jié)下游分子的活性，參與生長發(fā)育、細(xì)胞增殖、遷移、存活、凋亡等過程[18，19]，其表達(dá)的增強(qiáng)與肌腱和韌帶的愈合有關(guān)[20，21]。本研究中FAK在PLLA/Col-Ⅰ納米纖維中的表達(dá)較空白組及PLLA納米纖維組中有所升高。

綜上所述，本研究提示PLLA/Col-Ⅰ納米纖維支架對(duì)人肌腱成纖維細(xì)胞生長有促進(jìn)作用，且有利于Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和Col-Ⅹ基因以及整合素信號(hào)通路FAK基因的表達(dá)，能為組織工程技術(shù)進(jìn)行肌腱修復(fù)提供一種理想的支架材料。

[1] 李榮.組織工程化肌腱在肌腱修復(fù)過程中的作用[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(3):551-554.

[2] James R, Toti US, Laurencin CT, et al.Electrospun nanofibrous scaffolds for engineering soft connective tissues[J].Methods Mol Biol, 2011, 726:243-258.

[3] 邱南海，夏英鵬.組織工程化肌腱的實(shí)驗(yàn)研究與臨床應(yīng)用[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12(24):4718-4722.

[4] Kumbar SG, James R, Nukavarapu SP, et al.Electrospun nanofiber scaffolds: engineering soft tissues[J].Biomed Mater, 2008, 3(3):034002.

[5] 陳登龍，李敏，房乾.電紡絲技術(shù)在納米結(jié)構(gòu)高分子支架中的應(yīng)用[J].中國修復(fù)重建外科雜志，2007，21(4):411-415.

[6] Greiner A, Wendorff JH.Electrospinning: A fascinating method for the preparation of ultrathin fibers[J].Angew Chem Int Ed Engl, 2007, 46(30):5670-5703.

[7]Schofer MD, Boudriot U, Bockelmann S, et al.Effect of direct RGD incorporation in PLLA nanofibers on growth and osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells[J].J Mater Sci Mater Med, 2009, 20(7):1535-1540.

[8] 盛敏剛，張金花，李延紅.環(huán)境友好新型聚乳酸復(fù)合材料的研究及應(yīng)用[J].資源開發(fā)與市場(chǎng)，2007，23(11)：1012-1014，1028.

[9] 羅程，劉冰冰，歐陽麗斯，等.在肌腱損傷動(dòng)物模型修復(fù)過程中BFGF和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的特征[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)，2011，32(1)：31-38.

[10] 張達(dá)江，王亮.Ⅰ型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及其應(yīng)用研究的現(xiàn)狀與前景[J].生物技術(shù)通訊，2006，17(2)：265-269.

[11] 曹勝光，胡炳環(huán)，劉海清.靜電紡制備納米孔結(jié)構(gòu)聚乳酸超細(xì)纖維[J].高分子學(xué)報(bào)，2010，10(10)：1193-1199.

[12] Hu X, Shen H, Yang F, et al.Preparation and cell affinity of microtubular orientation-structured PLGA (70/30) blood vessel scaffold[J].Biomaterials, 2008, 29(21):3128-3136.

[13] 周炳華, 廖文波.改性聚乳酸-羥基乙酸/Ⅰ型膠原復(fù)合支架與兔耳軟骨細(xì)胞的細(xì)胞相容性[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14(3)：381-384.

[14] 許堯祥，李亞莉，陳立強(qiáng)，等.殼聚糖微球/納米羥基磷灰石/聚乳酸-羥基乙酸復(fù)合支架制備及其蛋白緩釋[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14(3)：452-456.

[15] Schofer MD, Fuchs-Winkelmann S, Gr?bedünkel C, et al.Influence of poly(L-lactic acid) nanofibers and BMP-2-containing poly(L-lactic acid) nanofibers on growth and osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells[J].Scientific World Journal, 2008, 8:1269-1279.

[16]Doroski DM, Brink KS, Temenoff JS.Techniques for biological characterization of tissue-engineered tendon and ligament[J].Biomaterials, 2007, 28(2):187-202.

[17] Pajala A, Melkko J, Leppilahti J, et al.Tenascin-C and type Ⅰ and Ⅲ collagen expression in total Achilles tendon rupture.An immunohistochemical study[J].Histol Histopathol, 2009, 24(10):1207-1211.

[18] Schaller MD.Cellular functions of FAK kinases: insight into molecular mechanisms and novel functions[J].J Cell Sci, 2010, 123(7):1007-1013.

[19] 梅梅，易杰.黏著斑激酶在整合素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的研究進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué)，2014，4(43)：1265-1269.

[20] Katsumi A, Orr AW, Tzima E, et al.Integrins in mechanotransduction[J].J Biol Chem, 2004, 279(13):12001-12004.

[21] Harwood FL, Monosov AZ, Goomer RS, et al.Integrin expression is upregulated during early healing in a canine intrasynovial flexor tendon repair and controlled passive motion model[J].Connect Tissue Res, 1998, 39(4):309-316.

Influence of PLLA/Col-Ⅰ nanofibers on growth of human tendon-derived fibroblast and the gene expression.

WANGWei,LIAOSuping,WEILei,WUBo,LIUJun.

DepartmentofOrthopaedics,Pu’aiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430033,China

Objective To explore the effects of PLLA nanofibers and PLLA/Col-Ⅰ nanofibers on human tendon-derived fibroblasts (TDFs), and the related gene expression.Methods TDFs were respectively cultured on the cover slip (blank group), PLLA nanofibers (PLLA group) and PLLA/Col-Ⅰ nanofibers (PLLA/Col-Ⅰ group).The growth of TDFs, and the gene expression of collagensⅠ, Ⅲ, Ⅹ and FAK during the course of culture were analyzed.Results The growth of TDFs in PLLA group was significantly inhibited as compared with blank group and PLLA/Col-Ⅰ group.The gene expression of collagen Ⅰ, collagen Ⅲ and collagen Ⅹ, and FAK was remarkably up-regulated in PLLA/Col-Ⅰ group as compared with PLLA group and blank group, but there was no significant difference between PLLA group and blank group.Conclusion This study indicates that PLLA/Col-Ⅰ nanofibers can promote the growth of TDFs, and can enhance the gene expression of collagen Ⅰ, collagen Ⅲ and collagen Ⅹ remarkably, as well as the gene expression of FAK.PLLA/Col-Ⅰ nanofibers may be an ideal scaffold of tissue engineering technology in the repair of tendon.

Tendon; Fibroblast; Nanofibers; Poly-L-lactic acid; Collagen Ⅰ

10.3969/j.issn.1674-8573.2015.01.001

武漢市衛(wèi)計(jì)委臨床醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(No.WX11C20)

430033 武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院骨科

王威，E-mail：orthww@163.com

2014-08-06